菊芋种质资源鉴定及DNA指纹图谱的构建

[目的]为挖掘菊芋优异种质资源,补充菊芋DNA指纹图谱。[方法]本研究以12份菊芋品种和8份美国菊芋资源为基础,通过8对SSR与7对SRAP引物,检测菊芋基因组DNA差异,对待测品种和资源通过毛细管电泳以进行品种差异鉴定、聚类分析和DNA指纹图谱的构建。[结果]共筛选出14对特异性良好的引物,其中7对SSR引物共扩增出435个位点,具有多态性位点234个,多态性比率为53.7%;8对SRAP引物共扩增出285个位点,具有多态性位点146个,多态性比率为51.2%。聚类分析结果表明,20份菊芋材料被分为六大类,相近地理来源的菊芋大都聚为同一大类,美国菊芋种质资源被单独分为几类。共筛选出6对特异性较高的引物序列,构建了供试菊芋品种和资源的DNA指纹图谱。[结论]为不同产地和来源的菊芋种质资源鉴定和溯源提供了理论基础。结果表明SSR、SRAP标记用于菊芋品种选育及鉴定是可行的。

菊芋叶绿体分离方法比较研究

以菊芋叶片为材料,通过比较提取其叶绿体DNA的5种方法(改良高盐-低pH法、Percoll密度梯度离心法、GENMED试剂盒物理法、GENMED试剂盒化学法及DNaseⅠ差速离心分离法),筛选出适合菊芋叶绿体NDA的提取方法。利用显微镜、核酸蛋白测定仪、琼脂糖凝胶电泳及菊芋基因特异引物RAPD检测。结果显示:改良高盐-低pH法分离得到的叶绿体在40×物镜下其数目多,浓度高,背景清晰,提取菊芋叶片cpDNA的OD_(260)/OD_(280)为1.926,质量浓度为295.63μg/μL。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测发现,cpDNA条带清晰整齐,无核DNA污染;且提取的cpDNA通过4对引物均能扩增到片段。结果表明,改良高盐-低pH法能够快速获得菊芋高质量的叶绿体DNA。

基于菊芋转录组的SSR分子标记开发及鉴定

利用菊芋(Helianthus tuberosus L.)转录组测序获得的63 089条Unigene(45.71 Mb)进行SSR查找分析,共检测出6 635个SSR位点,包含于5 452条Unigene中,出现频率为10.52%,SSR位点发生频率为8.64%,其中SSR位点的主要类型为二核苷酸重复,占总SSR的45.24%,其次为三核苷酸重复。SSR位点中共包含180种重复基序,其中出现频率较高的基序主要有AG/CT、ACC/GGT、ATC/ATG、AAG/CTT。设计36对多态性SSR引物组合进行扩增和多态性评价,其中,20对引物存在多态性差异,占55.56%。利用20对引物对18个菊芋资源样品进行多样性分析,分析表明,有效等位基因(Ne)在SSR位点上变化幅度较小;Shannon指数平均值为0.622;期望杂合度(He)和观察杂合度(Ho)平均值分别为0.434和0.447。系统进化树显示,菊芋资源可从块茎表皮颜色上分为白皮和红皮2大类。此外,从地域来源上进行聚类,能将18份菊芋种质资源聚为5类。以上分析表明,菊芋转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,利用获得的SSR标记可为菊芋及其近缘种的遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因组比较研究等提供丰富可靠的标记选择。

菊芋果聚糖合成关键基因1-SST克隆及序列分析

果聚糖是菊芋的主要贮藏物质,其代谢与产量形成和逆境适应性密切相关。为了解菊芋果聚糖合成代谢的机制,本研究以‘青芋1号’为研究对象,利用同源克隆方法,对果聚糖合成关键基因1-SST克隆及序列分析。结果表明,1-SST基因全长为3 925 bp,CDS大小为1 890 bp,由5个内含子和6个外显子组成。经生物信息学分析,预测1-SST蛋白分子量70 934.40 Da,等电点5.10,有两个属于糖基水解酶32家族的保守区,属于亲水性蛋白,以延伸结构(24.48%)和无规则卷曲(56.76%)为主要二级结构,在质膜外行使功能。系统进化分析表明,菊芋1-SST基因与向日葵遗传距离最近,与龙舌兰等不同科不同属的植物进化距离较远。本研究基于对菊芋中调控果聚糖合成代谢1-SST基因的克隆与生物信息学分析,为高等植物果聚糖代谢途径研究奠定一定的理论基础。

青海省辣椒疫霉菌SSR标记的遗传多样性分析

本研究采用SSR分子标记法对采集自青海省不同地区的80份辣椒疫霉菌及4份标准菌株进行遗传多样性分析。以采集的84份辣椒疫霉菌为实验材料,筛选出30对特异性高,条带清晰的引物进行辣椒疫霉菌的遗传多样性分析,30对SSR引物扩增的总条带数为127条,多态性条带为114条,多态性检测率为89.7%,PIC范围为0.381～0.837,平均每对引物的多态性信息量为0.594。本研究采用非加权组平均法进行了聚类分析,得出结论:遗传距离主要分布于0.42～0.94这个区间,平均遗传距离是0.62,相似性系数为0.71的时候可以将供试的84份辣椒疫霉菌分成9个大类,84份辣椒疫霉菌表现出了丰富的遗传多样性。实验结果显示,第一聚类中包括了来自6个地区的20个菌株,成为了优势种群。本研究为青海省辣椒疫霉菌抗病育种工作提供了一定的理论依据。

基于表型数据的菊芋核心种质初步构建

为更好地保存、研究和利用现有菊芋种质资源,本研究以250份种质材料的19个表型性状数据为基础,采用逐步系统聚类并优化聚类和取样方法,初步构建遗传冗余少、代表性强的菊芋核心种质。结果表明,在25%取样比例下多种系统聚类方法抽取的核心种质中,以最短距离法(C4)和优先取样法(S3)组合的C4S3方法所抽取的核心种质评价参数优于其他方法,对原种质的代表性最强。在C4S3法下优化取样比例,结果显示最合适的取样比例为20%,所抽取的核心种质C4S3-20用较少的材料获得了较高的遗传代表性。在C4S3-20方法下继续进行分组取样,评价参数表明分组取样效果不如整体取样,因而不予采纳。主成分分析显示C4S3-20保留了原种质的主成分,去掉了原种质的遗传冗余。最终获得了菊芋核心种质C4S3-20,包括50份材料,其与原种质的性状均值差异百分率为0%,方差差异百分率63.63%,极差符合率为100%,变异系数变化率为131.38%,表型保留比例为96.15%;Shannon多样性指数为1.595。本研究发现该核心种质很好地代表了原种质的遗传多样性,在一定程度上为菊芋资源的有效利用奠定了基础。

转基因烟草中半胱氨酸跨膜基因CYS生物信息学分析

在烟草中过量表达MYB转录因子LrAN2,能够激活上调花青素生物合成代谢通路,但富含半胱氨酸跨膜结构域蛋白A(CYS)的表达量明显降低。作为植物中一种重要的生物氨基酸,CYS的生物学研究鲜有报道。本研究克隆烟草的CYS基因,其全长为282 bp,编码氨基酸数94个。预测编码的蛋白分子量和等电点分别为24019.84 Da和5.23,并且序列中没有保守区。实验结果显示该蛋白具有亲水性,主要由α-螺旋(19.35%)和无规则卷曲(65.59%)构成,CYS蛋白质不通过跨膜区,在膜外进行作用。系统发育树显示,烟草CYS基因与辣椒CYS基因亲缘关系最近,其次是番茄的HTC基因和WIH2基因。本研究结果克隆并分析CYS基因编码区序列,为CYS基因的功能研究提供参考依据。