利用单片段代换系研究水稻抽穗期等位基因变异

为了研究水稻单片段代换系(Single segment substitution line,SSSL)与受体亲本HJX74(Huajingxian 74)抽穗期差异的原因,以HJX74和5个具有抽穗期差异显著性的SSSLs WY18(W06-15-18-3-11)、WY24(W08-16-3-2)、WY26(W11-15-7-1-1)、WY60(W15-3-1-38)、WY61(W17-10-5-5-35-9-2)为试验材料,对其代换片段上已知的抽穗期等位基因进行克隆,获取其CDS序列,用多种生物信息学方法进行序列比对,包括CDS序列、氨基酸序列,比较其氨基酸理化性质的异同及表达的差异。田间抽穗期表型性状调查结果表明,WY18、WY60、WY61相对于HJX74表现为晚抽穗,WY24、WY26表现为早抽穗。与HJX74相比,WY18代换片段上抽穗期等位基因DTH8存在4个SNP的差异、WY26中OsDof12存在7个SNP的差异、WY60 DTH8存在6个SNP的差异,但以上SNP的突变均未改变其氨基酸序列的亲水性及理化性质,表明这些抽穗期等位基因的突变可能并不是引起其抽穗期变化的原因。进一步通过qRT-PCR技术分析发现,WY18中DTH8、WY26中OsDof12的表达水平整体高于HJX74中的相应基因,表明该等位基因上游调节区域对其基因的表达进行了调控,可能是导致其抽穗期变异的原因。WY24中se14、WY61中Hd1存在明显的序列片段缺失,造成se14和Hd1等位基因功能缺失,可能是WY24、WY61抽穗期变异的主要原因。

利用CRISPR/Cas9技术编辑DTH8基因改良水稻99-25的抽穗期

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种的重要手段。为培育早熟、丰产、优质的种质资源,以农艺性状优良、迟熟粳稻品种香糯99-25为试验材料,构建了CRISPR/Cas9双靶点表达载体对抽穗期基因DTH8进行编辑,采用农杆菌介导法将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。用携带重组质粒的农杆菌菌液侵染水稻愈伤组织,成功获得了30株T_(0)转基因苗。对T_(0)植株利用潮霉素特异引物进行分子检测,其中阳性植株29株,阳性率高达96.7%。设计特异性引物对29株阳性苗的靶位点上下游600 bp进行PCR扩增测序,结果表明,7株转基因阳性苗在第2个靶点附近发生了碱基替换或插入突变。对这7株突变株系的抽穗期进行调查,发现DTH8-2、DTH8-5、DTH8-9、DTH8-10、DTH8-17、DTH8-21的抽穗期提前。利用实时荧光定量PCR检测发现DTH8-2、DTH8-9、DTH8-17与香糯99-25相比DTH8基因表达显著降低。成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对香糯99-25的DTH8基因进行了编辑,获得了抽穗期提前的DTH8突变体材料,为培育早熟、丰产、优质的水稻品种提供了种质资源。

分子标记辅助选择培育低直链淀粉含量抗除草剂水稻

为了提高水稻的食味品质和生产实践,培育了低直链淀粉含量和抗咪唑啉酮类除草剂2种性状兼顾的水稻新品系。利用带有低直链淀粉含量的南粳9108作为软米基因的供体,与显性核不育分离群体中不育单株进行杂交,并用南粳9108作为轮回亲本回交2次得到BC_(2)F_(1)群体,利用Wx-mq基因存在单核苷酸变异,对BC_(2)F_(1)群体的单株进行四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)扩增,依据其PCR产物带型可以准确区分Wx-mq纯合基因型、Wx-mq杂合基因型、非Wx-mq纯合基因型,筛选出农艺性状优良带有低直链淀粉含量的不育和可育单株;然后利用带有抗咪唑乙盐酸基因(Acetolactate Synthase,ALS)的金粳818作为抗除草剂基因的供体,与筛选出的带有低直链淀粉含量的不育单株进行杂交得到F_(1)群体,利用编码区ALS基因的碱基变异,进行等位基因特异PCR(AS-PCR)扩增,筛选出抗除草剂纯合基因型、感除草剂纯合基因型、抗除草剂杂合基因型。经ARMS-PCR鉴定结果表明,BC_(2)F_(1)不育群体中检测得到172株单株带型与南粳9108一致,含有糯性基因,性状为糯性;160株单株不含糯性基因;468株单株带型为双亲的杂合基因型。通过AS-PCR进行除草剂抗性鉴定,结果表明,在F_(1)群体1200个单株中,检测得到868个抗除草剂单株和332个感除草剂单株,其中纯合基因型624个,杂合基因型576个。经过逐代低直链淀粉含量和抗除草剂分子标记的选择,在F_(5)选育出同时具有除草剂抗性的低直链淀粉含量的水稻新品系6个。

光控诱导重组系统的开发与应用

位点特异性重组系统由重组酶和特异性识别位点两部分组成,是一种强大的基因操作工具,被广泛运用于生命科学研究。已开发的诱导型重组系统以时空方式精准调控细胞和动物的基因表达,被用于基因功能研究、细胞谱系示踪和疾病治疗等领域。根据诱导重组酶时空表达方式的不同,诱导型重组系统可分为化学诱导和光控诱导两种方式。光控诱导重组系统是利用光作为诱导剂,根据光控方式和对象的不同,可进一步分为光笼和光遗传学两类。光笼诱导重组系统是利用光敏基团来控制化学诱导剂或重组酶,光诱导前它们的活性被光敏基团抑制;在特定光照射后,它们的活性被恢复,进而实现光控诱导基因重组。光遗传学诱导重组系统是通过光遗传学开关介导分割型重组酶的重新激活来诱导基因重组。其中光遗传学开关由一系列基因编码的光敏蛋白组成,包括隐花色素、VIVID蛋白、光敏色素等。这些类型丰富的光控诱导重组系统为从高时空分辨率的维度解析基因的表达和功能提供了更多的工具,以满足日益复杂的生命科学研究需求。本文主要对不同类型光控诱导重组系统的开发原理及应用进行综述,比较其优缺点,最后对未来开发更多光控重组系统进行展望,旨在为系统优化升级提供理论基础和指导。