β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

为了实现多种纤维素酶基因的分泌型共表达,利用含有枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprB信号肽的穿梭质粒pP43JM2作为表达载体,将来源于热纤梭菌的内切葡聚糖酶基因celA与来源于多粘芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶基因bglA和bglB在枯草芽孢杆菌WB800中进行了分泌型的单独表达及共表达.结果表明,内切葡聚糖酶基因celA与β-葡萄糖苷酶基因bglA和bglB均能够在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,而且检测到了c elA和bglB基因在枯草芽孢杆菌中的分泌型共表达,其中,共表达菌株的胞外酶液分别与PAS C和纤维二糖底物反应时,释放出674 mg/L和24 mg/L的葡萄糖.而bglA基因只检测到在胞内表达,其胞内酶液以纤维二糖为底物时生成938.7 mg/L的葡萄糖.本研究为实现在枯草芽孢杆菌中纤维素酶多组分人工组装并为集成生物工艺菌种的构建奠定了一定的实验基础.

玉米芯残渣原料发酵微生物油脂的营养因子优化

玉米芯残渣是生产木糖后剩下的固体废弃物,也是一种高纤维素含量的生物质.为有效利用玉米芯残渣生产微生物油脂,对适于在玉米芯水解液中进行发酵的产油微生物进行了筛选,对水解液中添加的营养物质进行了优化,最后通过改变纤维素酶用量来提高水解液中的糖浓度以提高酵母的油脂产量.结果发现皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum 20271能够在水解液中进行油脂发酵;玉米浆(CSL)能显著提高酵母在水解液中的发酵速率,同时营养物不改变酵母的脂肪酸组分;利用纤维素酶用量为15 FPU/g DM得到的水解液进行油脂发酵时,酵母干重达到38.4 g/L,酵母的油脂产量达到12.3 g/L,油脂产率提高到0.064 g L-1 h-1,酵母含油率为32.1%.研究表明,皮状丝孢酵母T.cutaneum20271能够利用玉米芯残渣水解液进行油脂发酵,水解液经优化得到了较好的油脂发酵结果,本研究为微生物油脂发酵提供了廉价的原料,并为利用玉米芯残渣水解液生产油脂提供了切实可行的发酵方法.

构建伴有β-葡萄糖苷酶表达的乙醇发酵大肠杆菌

研究构建能够分泌表达纤维素酶的产乙醇菌株,实现降解木质纤维素生产乙醇的整合生物加工过程。文中通过克隆来自运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB,并通过Red重组将二者整合到大肠杆菌Escherichia coli JM109基因组中,首先构建了一株可以利用葡萄糖进行乙醇发酵的重组菌E.coli P81。随后将来源于多粘芽胞杆菌Bacillus polymyxa1.794的β-葡萄糖苷酶基因bglB在E.coli P81中进行了分泌表达,得到了一株可以进行纤维二糖降解和乙醇发酵双重功能的重组菌E.coli P81(pUC19-bglB)。该菌胞外分泌β-糖苷酶活达到84.78 mU/mL菌液,纤维二糖酶活达到了32.32 mU/mL菌液。该重组菌E.coli P81(pUC19-bglB)以纤维二糖为碳源进行乙醇发酵,乙醇得率达到了理论产率55.8%,而在葡萄糖和纤维二糖的共发酵中,其乙醇产量达到了理论产率46.5%。构建得到的此株整合生物加工大肠杆菌能够利用β-葡萄糖苷酶生产乙醇,为构建能利用木质纤维素分解产物生产燃料乙醇的高效、稳定生产用工程菌奠定了良好的基础。

外源功能基因在木质纤维素依赖型乳酸菌Pediococcus acidilactici DQ2中的表达

乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2是一株耐高温和耐木质纤维素降解抑制物的乳酸高产菌株.为了在P.acidilactici DQ2中建立外源蛋白表达系统,对常用的乳酸菌表达载体pMG36e进行改造,将其启动子P32更换为来源于P.acidilactici DQ2的L-乳酸脱氢酶基因的启动子PldhL.并通过新载体pTY36e成功表达了两种不同的外源基因:来源于维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白基因gfp和来源于多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa 1.794)的β-葡萄糖苷酶基因bglA,其中所表达的胞内β-葡萄糖苷酶活力为4.48 U g-1(细胞干重).此系统的成功构建为后续对该菌的基因工程改造奠定了基础.