ConA增强MΦ吞噬功能、杀瘤效应及产生效应分子的研究

目的了解 Con A在体内对小鼠腹腔 MΦ 吞噬功能、细胞毒作用及产生 NO、TNF- α、IL- 1的影响。方法分别测MΦ 吞噬鸡红细胞的能力 ,以 S180为靶细胞测 MΦ 依赖的细胞毒作用。以 griess试剂、L92 9细胞 MTT检测法、胸腺细胞增殖法测 MΦ 产生 NO、TNF- α、IL- 1的水平。结果 Con A活化的腹腔 MΦ 吞噬鸡红细胞的能力以及对 S180细胞的细胞毒作用显著强于 PBS对照组 (P<0 .0 1) ,并产生较高水平的 NO、TNF- α、IL- 1。结论 Con A能活化 MΦ 产生 NO等效应分子 ,发挥对

ConA对巨噬细胞活性的影响

目的 探讨ＣｏｎＡ对巨噬细胞（Ｍφ）活性的影响。方法以不同剂量的ＣｏｎＡ腹腔注射处理小鼠，４８ ｈ后收集腹腔Ｍφ做体外培养。分别以扫描及透射电镜观察Ｍφ的形态变化。分别以ＭＴＴ比色法和胸腺细胞增殖试验检测Ｍφ分泌ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β的水平，并用免疫细胞化学染色法检测这两种蛋白的表达强度。结果ＣｏｎＡ作用后的Ｍφ，表现为体积增大、指状突起增加和胞浆内线粒体等细胞器增加。ＣｏｎＡ活化的腹腔Ｍφ分泌ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β的水平增加，其在Ｍφ胞浆内的表达增强。结论ＣｏｎＡ具有激活Ｍφ增强其产生ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β的作用。

刀豆蛋白A活化小鼠巨噬细胞机理的初步探讨

探讨了刀豆蛋白A(ConA)活化巨噬细胞 (M)的机理。以ConA 5 0 0 μg腹腔注入预处理小鼠 4 8h ,并以PBS作对照 ,免疫组织化学染色法检测诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS)的表达 ;分别以原位杂交及流式细胞仪检测NF κBP6 5mRNA与NF κBRelA蛋白的表达 ;RT PCR了解TNF α、IL 1βmRNA的表达情况。ConA刺激后 ,iNOS在胞浆中表达增多 ;ConA处理组NF κBP6 5mRNA及NF κBRelA蛋白的表达均增加 ,RT PCR方法测到TNF α、IL 1βmRNA的表达水平也显著提高 (P <0 0 1)。ConA作用于M时 ,可能通过活化NF κB使iNOS、TNF α及IL 1β表达增强 。

pcDNA3-HBV瞬时转染对树突状细胞的影响

目的:研究HBV感染对树突状细胞功能的影响,探讨慢性乙型肝炎患者免疫耐受发生的机制。方法:利用脂质体转染的方法,以携载HBV全基因的真核表达载体pcDNA3-HBV及对照空载体pcDNA3质粒DNA分别转染小鼠骨髓细胞,以细胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α诱导培养树突状细胞,RT-PCR检测转染后HBVPreS1 mRNA的表达。流式细胞术检测转染前后树突状细胞表面分子CD80的表达,3HTdR掺入法观察其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,流式细胞术进一步检测NF-κB RelA蛋白的表达。结果:pcDNA3-HBV瞬时转染后树突状细胞CD80表达降低,其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力下降,NF-κB RelA蛋白表达显著减少。结论:HBV可抑制树突状细胞的分化成熟,降低其刺激T淋巴细胞增殖的功能,这可能是慢性乙型肝炎患者免疫耐受的机制之一。

IL-18与免疫相关性疾病

IL 18是典型的Th1样细胞因子 (CK) ,与IL 12有协同作用 ,生物学效应具有多样性 ,是一种具有广泛应用前景的CK。本文就其在实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)、类风湿性关节炎 (RA)、Ⅰ型糖尿病、变应性哮喘、炎症性肠病 (IBD)

刀豆蛋白A对结核病小鼠的保护作用及其机理研究

目的 观察刀豆蛋白A(ConA)对结核病小鼠的保护作用及对TH1/TH2 平衡的调节。方法 以ConA 10 0 (E2组 )或 5 0 0 μg(E1组 )腹腔内注射预处理结核病小鼠 ,观察生存时间、肺组织病变及菌落计数 ;检测脾细胞培养上清液中的IFN γ、IL 4。结果 ConA可延长结核病小鼠的存活期。第 2周 ,感染对照组 (C组 )肺组织大面积受累 ,而E2组病变较轻 ,E1组仅局部有炎性细胞浸润 ;第 4周 ,C组出现严重的炎症变化 ,E2组病变范围小 ,E1组病变局限化 ,出现淋巴细胞结节。E1、E 2组的菌落计数于第 2周显著低于C组 ;第 4周 ,E1组显著低于E2及C组。第 2周 ,E1、E2组IFN γ的水平显著高于C组及正常对照组 (P<0 .0 1) ;第 4周 ,E1组IFN γ水平显著高于C组及E2组 (P <0 .0 1) ,而IL 4变化不明显 (P >0 .0 5 )。结论 ConA预处理可使TH细胞以TH1应答为主 。

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的:为诱导HBV特异性CTL,构建HBV全基因真核表达载体,并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法:以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3,回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3,T4DNA连接酶连接HBV和pcDNA3,转化、筛选,酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞,经G418筛选,ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达,RT-PCR检测转染细胞中PreS1mRNA的表达。结果:经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV,转染HepG2后,建立了新的肝癌细胞系HepG2.02G,细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg,PreS1mRNA在转染细胞中表达。结论:经体外重组,获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体,并可在肝癌细胞中稳定表达。

IFN-γ与TNF联合治疗结核菌感染小鼠疗效及机理的研究

目的研究 IFN- γ和 TNF对结核分枝杆菌感染小鼠的疗效及作用机制。方法小鼠感染结核分枝杆菌后第 5d给予 IFN-γ和 /或 TNF治疗 ,观察治疗后半数死亡时间、一定时间内的死亡率、脾脏内活菌数 ,检测脾细胞分泌 IFN-γ和 IL -4水平 (EL ISA法 )及 MΦ 产生 NO水平 (用 Griess试剂 )。结果与单纯攻毒组比较 ,联用 IFN- γ和 TNF组感染小鼠半数死亡时间明显延长、35 d内的死亡率从 10 0 %降低到 2 0 %、脾脏内活菌数显著减少 ,脾细胞 IFN- γ分泌水平明显升高 ,IL- 4分泌水平显著降低 ,MΦ产生 NO水平明显增加。结论 IFN -γ和 TNF联合诱导 MΦ产生 NO,促进 TH1 细胞反应 ,抑制 TH2 细胞反应 ,改变了 TH1 / TH2 平衡 。

TRAIL基因多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究

目的检测肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因第5外显子3′-非编码区1525G/A、1595C/T位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),探讨TRAIL基因SNPs与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)发生的关联性。方法采用病例对照的方法,按照美国风湿病协会诊断标准,收集SLE病人167例、正常对照190例,利用聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性(polymerase chain reaction-restric-tion fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法检测TRAIL基因1525、1595两位点基因多态性,计算基因型及等位基因频率,进行χ2检验。结果 TRAIL基因1525G/A和1595C/T位点3种基因型1525GG/1595CC、1525GA/1595CT、1525AA/1595TT在正常对照组和SLE病例组中的分布分别为23.3%、54.6%、22.1%;35.3%、50.3%、14.4%,SLE病人组中1525/1595位点GG/CC基因型频率显著高于正常对照(χ2=7.77,P<0.025),G/C等位基因的频率显著高于正常对照组(χ2=7.12,P<0.005)。结论中国汉族人TRAIL基因第5外显子3′-UTR1525G/A、1595C/T位点多态性与SLE的发病有关,TRAIL基因1525/1595位点GG/CC基因型是SLE的易感基因型。

血清胱抑素C在系统性红斑狼疮患者肾功能检测中的价值

目的探讨血清胱抑素C（CysC）在系统性红斑狼疮（SLE）患者肾功能检测中的价值。方法研究对象为78例SLE患者（观察组）、67例健康体检者（对照组）；采用乳胶颗粒增强散射免疫比浊法测定血清CysC、β2-微球蛋白（β2-MG），酶法测定血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）。结果与对照组比较，观察组肾小球滤过率（GFR）〉80mL／（min·1.73 m^2 ）者血清CysC、BUN、SCr、β2-MG无显著差异；GFR40～80ml／（min·1.73 m^2 ）者仅血清CysC明显升高（P〈0．01）；GFR〈40ml／（min·1.73 m^2 ）者血清CysC显著升高（P〈0．001），BUN、SCr、β2-MG亦明显升高（P〈0．01）。结论血清CysC是反映肾小球滤过功能的指标，较BUN、SCr、β2-MG更敏感，可作为SLE患者肾损害的早期诊断指标之一。

创建“多轨教学模式”提高医学生自主学习能力

为了提高学生自主学习的能力和创新性思维,根据信息时代、网络时代的特点,结合我国现有的教育体系、教学资源,在继承传统教学优点的基础上引入新的教学理念,创新性提出了具有中国特色的“多轨教学模式”。“多轨教学模式”的宗旨:一方面继承传统教学的优点,培养学生扎实的理论基础;另一方面引入先进的现代化教学理念,充分利用现有的实验条件和网络资源,激发学生主动学习兴趣和创造能力,体现学生在教与学中的主体地位,提高学生的综合素质。“多轨教学模式”经过4年在山东大学7年制医学免疫学教学中的实施,获得了良好的效果,初步建立了切实可行的“多轨教学模式”方案,具有很好的可操作性,很容易推广。

高生物安全性内皮抑素真核表达载体的构建

目的:构建具有高度生物安全性的人内皮抑素(Endostatin)真核表达载体,为抗血管生成剂转基因治疗肿瘤奠定实验基础。方法:采用被FDA批准的可用于人体实验的真核表达质粒pVAX1为载体,PCR扩增带有人IgGγ链信号肽序列的Endostatin基因,KpnI、EcoRI双酶切载体和PCR产物,T4DNA连接酶连接,构建重组表达载体,命名为pVAX鄄sEN。重组子经KpnI、EcoRI双酶切、PCR及测序鉴定。将测序正确的重组载体经脂质体转染体外培养的人肝癌细胞系(HepG2),用RT鄄PCR、ELISA方法鉴定Endostatin的表达。结果:PCR获得了610bp带有信号肽的Endostatin基因,测序结果表明,正确构建了含有信号肽及Endostatin的真核表达载体pVAX鄄sEN。重组子转染HepG2细胞72h后,RT鄄PCR显示有EndostatinmRNA表达。ELISA证实,转染重组载体的HepG2细胞上清有目的蛋白的高效表达,表达量为172.34ng/ml。结论:成功构建了高生物安全性真核表达载体pVAX鄄sEN,为肝癌等实体瘤的基因治疗研究奠定了基础。

γ-干扰素对HBV相关性肝癌细胞凋亡的免疫调节效应研究

目的:以转染HBV全基因组并稳定分泌病毒抗原的HepG2.2.15肝癌细胞系为细胞模型,探索IFN-γ对HBV相关性肝癌的免疫调节效应。方法:用HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒测定IFN-γ作用0,6,12,24h后,HBV病毒颗粒的分泌表达水平。通过MTT法检测不同剂量IFN-γ对新型凋亡配体TRAIL与TWEAK的生长抑制效应的调节作用,不同剂量IFN-γ对TRAIL与TWEAK的凋亡诱导效应的调节作用。结果:IFN-γ在不同的时间点对HBsAg和HBeAg的分泌均具有抑制作用,IFN-γ能够显著增强TRAIL和TWEAK对HepG2.2.15肝癌细胞系的生长抑制效应和凋亡率。讨论:IFN-γ是HBV感染后的一个重要的免疫效应分子,它可以通过抑制病毒复制和增强免疫监视分子的效应而在HBV相关性肝癌中发挥抗病毒和抗肿瘤效应。

稳定高表达小鼠Tim-4巨噬细胞系RAW264.7-T4的建立

目的建立研究小鼠Tim-4功能的细胞模型。方法常规分离小鼠腹腔巨噬细胞,RT-PCR扩增Tim-4全长基因片段,构建含Tim-4全基因片段的真核表达载体pcDNA3.0-Tim-4,通过BamHⅠ、HindⅢ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pcDNA3.0和pcDNA3.0-Tim-4分别转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,通过G418加压筛选,建立稳定高表达Tim-4的RAW264.7,并采用RT-PCR、流式细胞术和免疫细胞化学染色法检测Tim-4 mRNA和蛋白的表达水平。结果RT-PCR扩增产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,与pcDNA3.0连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GenBank报道序列一致。RT-PCR结果显示,RAW264.7-T4细胞表达Tim-4 mRNA的水平显著高于对照组,流式细胞术显示RAW264.7-T4高水平表达Tim-4蛋白,免疫细胞化学染色表明Tim-4主要表达于胞膜。结论成功构建了携载小鼠Tim-4全基因的表达载体,并用该重组体建立了稳定高表达Tim-4 mRNA和蛋白的小鼠巨噬细胞系,为进一步探讨Tim-1与Tim-4的相互作用及对免疫细胞功能的影响奠定基础。

表皮生长因子受体介导的新型肝癌靶向性基因转移

如何使得外源基因稳定地从吞噬溶酶体中释放 ,是提高受体介导基因转移系统转移效率的关键。本文以绿色荧光蛋白质粒为报告基因 ,合成针对表皮生长因子受体 (EGFR)的相应 16肽配体寡肽和流感病毒血凝素HA2 0寡肽 ,并与多聚赖氨酸连接 ,连接物与绿色荧光蛋白报告基因按 1∶1混合 ,构建新型肝癌靶向性转移系统 ,命名为四元复合体。分别以四元复合体和脂质体在体内外进行基因转染 ,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果表明 ,四元复合体介导基因定向转染至肿瘤细胞 ,其转染率为 44 95 % ,显著高于脂质体转染组( 3 3 0 9% ,P <0 0 5 ) ,动物实验证明 ,四元复合体介导绿色荧光蛋白特异性表达于肿瘤细胞 。

两种端粒酶逆转录酶启动子真核表达载体的构建

目的:构建hTERT启动子和保留HBV同源序列的缺失点变hTERT启动子(pGL3del445)的真核表达载体,为进一步研究HBV与hTERT启动子的关系奠定实验基础。方法:通过双酶切及PCR方法从pCRTRTP载体上将全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的基因序列克隆到pPLbasic多克隆位点上,构建真核表达载体pGL3TRTP与pGL3Bdel445,将该两质粒与pRLtk共转染不同细胞系,评估其端粒酶启动子活性。结果:经测序证明成功构建了全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的真核表达载体pGL3TRTP和pGL3Bdel445,共转染实验中,证实在永生细胞系中重组子高效表达,在非永生正常细胞中重组子不表达。结论:构建的两种重组表达载体具有端粒酶启动子活性,在不同端粒酶表型的细胞系中其表达具有选择性。

脂质体介导EndostatinIL-12基因联合治疗移植型鼠肝癌的实验研究

目的:探讨脂质体介导Endostatin及IL-12基因联合治疗肝癌的可行性。方法:将已构建的Endostatin和IL-12真核表达载体给荷瘤BALB/c鼠瘤内注射,每周两次测量瘤体积。ELISA法检测肿瘤局部IL-12、IL-2、Endostatin含量,MTT法检测NK细胞杀伤活性,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况。结果:联合治疗组肿瘤体积明显小于其它各组(P<0.05);肿瘤局部IL-12、IL-2、Endostatin的表达明显高于pVAX1空载体和生理盐水对照组(P<0.05);NK细胞杀伤率和肿瘤细胞凋亡率分别为52.0%和48.2%。结论:联合应用Endostatin和IL-12基因可有效抑制鼠肝癌的生长。

四元复合体介导C-MYC反义RNA抑制肝癌细胞生长增殖

目的探讨四元复合体介导的C-MYC反义RNA转移系统对肝癌细胞系HepG2.2.15致瘤性的体内外抑制作用。方法C-MYC反义RNA四元复合体体外瞬时转染HepG2.2.15细胞,流式细胞术检测C-MYC蛋白的表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化,MTT法测定细胞增殖代谢活性。以HepG2.2.15细胞制备荷瘤裸鼠模型,局部瘤内注射C-MYC反义RNA四元复合体或联合注射IFN-α,称量瘤重,免疫组化方法检测肿瘤组织C-MYC蛋白的表达。结果C-MYC反义RNA可显著降低细胞C-MYC蛋白的表达水平,使细胞生长停滞于G0/G1期。体内抑瘤实验显示,反义治疗组瘤体C-MYC蛋白表达降低,瘤重(1.72±0.16)g,显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。联合IFN-α注射组抑瘤效果更佳。结论肿瘤组织靶向性C-MYC反义RNA转移系统在体内外均可有效降低C-MYC蛋白的表达,抑制细胞的生长增殖。体内联合IFN-α可取得更佳的抑瘤效果。

重组人可溶性DR5蛋白的表达、制备及其生物活性检测

目的:纯化毕赤酵母GS115菌株表达的重组人可溶性死亡受体5(DR5)蛋白,并研究其对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)所诱导细胞凋亡的阻断效应?方法:大量扩增可溶性DR5酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株,收集上清,利用ProBondTM亲和层析柱纯化获得重组可溶性DR5蛋白,用SDS-PAGE?Western Blot检验纯化产物的特异性和纯度?用MTT法检测纯化的可溶性DR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡作用的阻断效应?结果:转化阳性的毕赤酵母GS115菌株可成功表达分子量为26 kD的可溶性DR5蛋白,经ProBondTM亲和层析柱纯化,SDS-PAGE?Western Blot鉴定,结果显示获得了高纯度的重组人可溶性DR5蛋白,蛋白产量达20 μg/ml;体外活性检测结果显示,纯化的可溶性DR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的Hela细胞的凋亡,阻断率最高达53.6%?结论:经纯化后的重组人可溶性DR5蛋白可有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应?

军团菌在巨噬细胞与中性粒细胞内的生长效应研究

目的探索比较军团菌毒性株在巨噬细胞与中性粒细胞内的生长效应。方法诱导分化人的单核细胞系U937细胞使其成为类巨噬细胞,并分离诱导人的外周血单核巨噬细胞以及中性粒细胞;用不同生长时期的军团菌毒力株AA100,感染诱导分化成功的单核巨噬细胞和中性粒细胞,并比较其在巨噬细胞和中性粒细胞中的生长复制状况。结果过对数生长期的军团菌毒力株能够在巨噬细胞内大量复制,扩增状况呈生长阶段的依赖性;而各生长时期的军团菌毒力株均不能在中性粒细胞内大量扩增。结论军团菌逃逸机体的杀伤作用和免疫监视作用与其能够在巨噬细胞内大量复制密切相关。