维生素D受体特异性shRNA慢病毒载体及ASMCs稳转株的构建

目的构建特异性靶向大鼠维生素D受体(VDR)基因的RNA干扰慢病毒载体,并筛选构建VDR基因稳定沉默的ASMCs细胞株。方法设计大鼠VDR的4组短发夹状RNA(shRNA)靶序列,合成的DNA双链与线性化的慢病毒LV3载体相连,构建LV3-sh-VDR重组慢病毒质粒。经酶切及测序鉴定后,进行病毒包装和病毒滴度检测,而后转染大鼠ASMCs,分组为干扰组(转染VDR shRNA)、阴性对照组(仅转染慢病毒载体)和空白对照组(未转染载体)。经嘌呤霉素抗性筛选后,建立ASMCs的VDR-shRNA稳定细胞株,用逆转录聚合酶链反应和Western Blotting法分别检测各组ASMC细胞中VDR mRNA及蛋白的表达水平。结果经酶切和测序鉴定,成功构建4个VDR重组慢病毒载体。慢病毒转染ASMCs后,经嘌呤霉素抗性成功筛选到ASMCs的VDR-shRNA稳定细胞株,干扰组ASMCs的VDR mRNA和蛋白的表达量与阴性对照组及空白对照组相比均明显下降。结论成功构建VDR稳定沉默表达的大鼠ASMCs细胞株,为研究VDR对哮喘生物学行为的影响提供细胞模型。