氨基酸突变对细胞色素P45 0BM-3羟基化吲哚能力的影响

利用饱和定点突变技术对细胞色素P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)(PT)的168和435氨基酸位点分别进行随机突变,根据其羟基化吲哚生成的靛蓝在670nm处具有特殊吸收峰进行高通量筛选,获得了三个高于亲本酶(PT)的突变酶D168H、D168L和E435T。通过考察突变酶反应动力学参数、电子耦合率、热稳定性、最适pH以及区域专一性的变化情况,发现相对亲本酶而言所有的突变酶对底物吲哚的亲和力和催化效率都得到了不同程度的提高,其中突变酶D168H的kcat值比亲本酶提高了3倍多;突变酶D168H的电子耦合率比亲本酶大约降低了2倍,而突变酶D168L和E435T的电子耦合率却有轻微的提高;所有突变酶均在pH8.2附近表现出最大羟基化吲哚生产靛蓝的能力;突变酶D168H对吲哚的区域选择性得到了提高,主产物靛蓝从亲本酶的72%提高到了93%。另外,热稳定性实验表明:尽管突变酶D168H和D168L的热稳定性较亲本酶有所降低,但活力的大幅度提高并未对酶的热稳定性造成大的伤害。以上所有的结果为了解细胞色素P450 BM-3结构与功能关系提供了有用的信息,同时为进一步定向进化P450BM-3提高其功能特性提供了进化模板。