血常规比值参数在类风湿关节炎中的诊断价值

目的 分析血常规比值参数与类风湿关节炎(RA)之间的关系,探讨其临床诊断价值。方法 收集并比较217例RA患者(RA组)和211例体检健康者(对照组)的总炎症全身指数(AISI)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、衍生的NLR(dNLR)、血红蛋白与淋巴细胞比值(HLR)、血红蛋白与血小板比值(HPR)、淋巴细胞与单核细胞比值(LMR)、血小板与淋巴细胞比值(PLR)、血小板与单核细胞比值(PMR)、系统性免疫性炎症指数(SII)、全身炎症反应指数(SIRI)。分析RA患者上述指标与临床评分、炎症和免疫指标的相关性;采用Logistic回归分析血常规比值参数与RA的关系;受试者工作特征(ROC)曲线评价血常规比值参数对RA的诊断价值。结果 与对照组相比,RA组PMR、LMR、HPR和HLR降低(P<0.05),而红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体(aMCV)、NLR、d NLR、PLR、SII、SIRI、AISI升高(P<0.05)。RA患者DAS28评分与ESR、CRP、RF、aMCV、PLR呈正相关,而与HPR呈负相关(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示高水平的ESR、CRP、RF、ASO、PLR是影响RA发生的独立危险因素,而高水平PMR和HLR是保护因素(P<0.05)。基于ESR、CRP、RF、ASO、PLR、PMR和HLR的联合检测模型对RA的诊断效能优于单一指标,曲线下面积(AUC)为0.889(95%CI:0.852~0.927)。结论 PLR和HPR与RA临床活动度相关,多指标联合检测可为RA辅助诊断提供新思路。

利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异

依据乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus;HBV)聚合酶基因序列研制HBV基因芯片,此芯片可分析HBV的7个基因型、4种血清型和HBV聚合酶基因rtV173、rtL180、rtM204和rtV207位点的突变。利用此芯片对A、B两组共计45例拉米夫定治疗12个月的患者进行服药前和服药后3、6、9、12个月的动态检测,其中C基因型39例,且血清型均为adr:B基因型6例,其血清型均为adw。在完成全程检测的38例患者中,17例ALT升高的A组出现1例拉米夫定耐药变异株,而21例ALT正常的B组出现4例变异株,且所有变异株均为rtM204V/rtL180M,其中2例野生株和变异株共存。rtM204V变异最早在服药6个月时出现,随后出现rtL180M变异。10份PCR产物测序分析表明,芯片检测结果与测序结果基本一致,仅在rtL173位点出现1例差异。进一步分析HBV DNA变异与HBV DNA含量、ALT水平和HBeAg血清转换率的相关性,初步结果表明变异株的出现与治疗过程中的DNA反弹呈正相关,而与起始HBV DNA水平、ALT值无关联。HBV基因芯片可初步用于HBV DNA 检测,可能是临床追踪评价抗病毒治疗效果的较好方法之一。

肝细胞癌高表达基因cDNA文库的构建及生物信息学分析

目的:构建肝细胞癌的高表达基因cDNA文库并进行相应的生物信息学分析。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术,以7对肝癌组织和癌旁组织为实验材料,构建肝癌高表达基因的cDNA文库;使用BioEdit、BLAST和EGAD等软件进行生物信息学分析。结果:获得1450个白色阳性克隆,经PCR扩增后均有100～1000bb的插入片段,经杂交验证选取125个克隆进行测序;经BLAST、EGAD等生物信息学工具分析获得基因83个,其中细胞分裂相关基因5个,参与细胞信号转导或通讯的基因5个,参与细胞结构或运动的基因7个,细胞或器官防御相关基因11个,参与细胞内基因转录或蛋白表达的基因22个,代谢相关基因18个,另有15个未归类基因。结论:利用SSH技术可构建肝细胞癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,为进一步深入探讨肝癌的诊断、治疗和预后评估等提供更多的分子指标。

高转移人肺癌细胞系遗传稳定性研究

染色体畸变分析为肿瘤细胞遗传学研究的常规方法。近来,有研究表明癌细胞长期培养并不会引起额外特征性染色体改变。PG 癌系为我室建立的具有高转移性人肺癌细胞系,在体外已传代数年。最近,我们从 PG母系中分离出多个亚克隆,并具有相同的生物学特性。为探讨其遗传稳定性及进一步研究分子遗传改变与生物学行为的关系,我们比较了 PG 母系与两个亚克隆的染色体畸变。结果表明:1,3,6,7,11,13,17,19号染色体异常与其它肺癌的研究报道相近;母系与亚系的染色体畸变类型几乎一致。因此说明 PG 细胞在长期培养过程中,其遗传特性是稳定的,并相似于一般肺癌遗传学改变。

半定量RT-PCR检测9个基因在肝癌中的差异表达

目的对AFP、COL1A2、UBD、FOXM1b、GPC3、SPINT2等6个高表达基因和DLC-1、WWOX、IGFBP3等3个低表达基因在肝癌和癌旁不同距离组织中的表达进行研究,以确定从癌组织逐渐向正常组织的过渡过程中,这些基因的表达是否存在趋势性变化,以及这些基因的表达与临床病理特征之间是否存在联系。方法收集肝癌手术标本并保存于-80℃;从肝癌及其对应的癌周组织中提取mRNA,然后应用RT-PCR技术对9个基因进行扩增,PCR产物行凝胶电泳;最后用电泳条带灰度分析软件对9个基因的表达情况进行半定量分析。

人SRY基因核心序列的扩增和分析

根据人SRY基因序列,设计合成一对引物,在男性DNA中特异扩增一条422 bp的DNA片段,而女性中无任何扩增带出现。进一步将该片段克隆,限制性内切酶分析和测序表明,扩增片段就是SRY基因的保守区。随后利用其作探针进行分子杂交,在男性DNA中获得一个约12kb的带,与文献相一致。因此,利用该引物或克隆片段,在临床上可用于性连锁遗传病的产前诊断和性分化异常个体的研究。

SEN病毒的研究进展

发现和鉴定新型肝炎病毒一直是肝炎研究的热点之一。在2000年发现的SEN病毒被认为是一种新的肝炎病毒,最初的文献推测其可能与输血后非甲非戊型肝炎密切相关;但通过近两年的研究表明,其作为肝炎致病因子的地位有待进一步证实。本文从SEN病毒的基因组结构、检测方法、与肝炎的相关性和流行病学等方面重点介绍了其研究现状和所面临的问题。

复方中药对肝星状细胞胶原合成与降解的影响

目的:观察中药复方丹参对肝星状细胞胶原合成与降解的影响。方法:选择肝星状细胞系作为体外研究对象,MTT法观察药物对细胞增殖的影响,ELISA法检测细胞上清液Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量,RNA-cDNA分子杂交检测细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及TGF β1 mRNA稳态水平。逆转录多聚酶链反应检测间质胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达水平。结果:中药复方丹参明显抑制肝星状细胞增殖且呈剂量依赖趋势,与对照组比较,中药组细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量明显降低,细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及TGF β1 mRNA稳态水平明显降低,间质胶原酶基因表达水平明显增强,金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达水平明显受到抑制(P<0.01)。结论:中药复方丹参可能通过抑制肝星状细胞的增殖,抑制胶原的异常合成,促进异常沉积胶原的降解,从而起到抗肝纤维化的作用。

乙型肝炎患者并发慢加急性肝衰竭诱因及转归分析289例

目的:探讨乙型肝炎并发慢加急性肝衰竭的诱因及其转归.方法:回顾289例乙型肝炎并发慢加急性肝衰竭患者临床资料,对其病因、转归等进行分析.结果:HBV活动及变异为乙型肝炎并发慢加急性肝衰竭最主要诱因(占50.52%),感染(非病毒性)、消化道出血、药物、腹泻、酒精、HEV分别占:24.57%、4.50%、4.15%、3.46%、2.42%、2.42%.289例患者中(年龄40-70岁之间的达80.28%)226例接受了人工肝治疗,总好转率为45.33%,死亡率为44.98%.结论:HBV活动及变异居乙型肝炎并发慢加急性肝衰竭所有诱因之首.乙型肝炎基础上的HEV、HBV活动及变异免、自身疫性肝病诱发的慢加急性肝衰竭好转率高于肝癌诱发慢加急性肝衰竭好转率.

人胎儿肝干细胞异种移植治疗小鼠暴发性肝功能衰竭

目的:探讨人胎儿肝干细胞异种移植治疗暴发性肝功能衰竭伴严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的可能性与有效性。方法:改进Seglen胶原酶(Ⅳ型)原位灌注结合Percoll密度梯度离心法分离纯化中期妊娠流产的男性胎儿肝干细胞,经肝脏注射移植(106细胞)治疗D-氨基半乳糖(1600mg/kg)诱发的暴发性肝功能衰竭雌性SCID小鼠(治疗组),于移植前及移植后24,48,72h及1周取血测定血氨、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBiL),于移植后1,2,4周取受体肝脏组织,PCR方法检测性别决定因子,并与未移植肝干细胞小鼠(对照组)比较。结果:治疗组小鼠中位生存时间较对照组延长(123.4hvs70.4h)(P<0.05);移植后治疗组血清ALT、TBiL及血氨水平降低,各时间点均低于对照组(P<0.05);治疗组肝脏病理损伤逐渐减轻,存活2周小鼠肝脏组织中性别决定因子呈阳性表达,随时间延长表达增强。结论:人胎儿肝干细胞移植能延长暴发性肝功能衰竭SCID小鼠的存活时间,改善其肝功能及肝脏病理指标。

外周血IL-6对早期肝癌微波消融后复发的预测

目的探讨血清中白细胞介素-6(IL-6)和IL-22对早期乙型病毒性肝炎相关肝细胞癌患者(HBV-HCC)微波消融(MWA)治疗后复发的预测作用。方法收集49例经MWA治疗早期HBVHCC患者术前外周血,应用ELISA检测外周血IL-6与IL-22的含量,同期30例健康人作对照。据x-tile软件计算cut-off值将IL-6和IL-22水平分为高水平组和低水平组,Kaplan-Meier分析两组的无瘤生存期,Log rank检验差异性,Cox回归筛选影响HBV-HCC复发的危险因素。结果 HCC组的IL-6与IL-22水平明显高于对照组(IL-6:13.20(11.87~15.79)pg/ml和10.47(9.50~13.82)pg/ml,P=0.001;IL-22:42.18(34.39~57.44)pg/ml和25.45(22.31~30.12)pg/ml,P<0.001)。Kaplan-Meier分析显示HCC患者术前低IL-6、高总胆红素和低白蛋白水平预示较短无瘤生存期,IL-22对HCC复发的影响差异无统计学意义。Cox回归多因素分析显示低IL-6(≤13.2 pg/ml,HR:3.721,95%CI:1.674~8.272,P=0.001)与低白蛋白水平(≤41.0 g/L,HR:2.085,95%CI:1.101~3.950,P=0.024)是影响肝癌复发的独立危险因素。结论术前IL-6和白蛋白水平可作为MWA治疗HBV-HCC患者预测复发的指标。

肺癌患者外周血中表面活性蛋白D mRNA的表达及临床意义

背景与目的:循环癌细胞的灵敏检测对于肺癌患者的预后及选择合适的治疗方法很重要。为此,我们建立了利用表面活性蛋白D(surfactantproteinD,SP-D)作为基因标志的RT-PCR方法,检测肺癌患者外周血中的癌细胞,并初步探讨其临床意义。方法:采用优化的套式RT-PCR方法,对26例伴肺外转移肺癌患者,37例无转移肺癌患者,15例良性肺疾病患者及15例健康志愿者外周血中SP-DmRNA的表达进行分析。结果:1)该方法灵敏度可达1×10-6,特异性强;2)采用此方法,伴肺外转移和无转移肺癌患者外周血中SP-DmRNA的检出率分别为92.3%(24/26)和24.3%(9/37),所有良性肺疾病患者和健康对照外周血中均未见SP-DmRNA的表达。结论:SP-DmRNA可能是检测肺癌患者外周血中是否存在癌细胞的一个有价值的指标,对肺癌的转移倾向有一定的提示作用,并有可能为制定治疗方案和评估预后提供重要的参考依据。

拉米夫定耐药后序贯治疗中HBV准种的演变

目的:探讨拉米夫定(LAM)耐药后序贯治疗中HBV准种的演变特点.方法:收集7例拉米夫定耐药患者序贯治疗中的血清,对HBV聚合酶基因逆转录酶区进行PCR扩增克隆并测序,结合临床用药分析序列突变,探讨其演变特征.结果:患者1、4、5在序贯治疗中LAM耐药变异株一直存在,主要以M204I+L80I、M204I+L80I+L180M、M204V+L180M+G173L、M204V+L180M为主,所占比例在不断发生变化.患者2、3在序贯治疗中检测出野生株,但患者2在后续治疗中又选择出LAM耐药变异株.患者6在ADV联合ETV治疗时、患者7在单用ADV治疗时测时分别测出双重耐药株M204V+L180M+G173L+T184A和M204V+L180M+G173L+236D.结论:拉米夫定耐药后序贯治疗中原耐药突变不易消失,且容易在此基础上筛选出交叉耐药株或多重耐药株,他的出现影响序贯治疗的应答甚至导致序贯治疗的失败.

IL-10基因启动子区单核苷酸多态性与乙型肝炎病毒感染后疾病转归的关系

目的:探讨IL-10基因-1082、-819位点的单核苷酸多态性与HBV感染后疾病转归的关系.方法:采用TaqManSNP基因分型和基因测序的方法检测187例健康人群、94例感染HBV后自愈者、130例慢性乙型肝炎患者、119例乙型肝炎肝硬化患者以及170例HBV相关性肝癌患者IL-10-1082、-819位点的基因型及等位基因的分布及其差异.结果:全部700例研究对象-1082位点的基因型分布为AA基因型占82.29%、AG占16.00%、GG占1.71%;等位基因频率:A为90.29%,G为9.71%.-819位点的基因型分布为TT占41.43%、TC占48.14%、CC占10.43%;等位基因频率:T为65.64%,C为34.36%.两位点等位基因和基因型分布在各组无统计学差异.以自愈组为对照,-1082AG基因型和G等位基因对慢乙型肝炎和肝硬化组的风险度降低,-819TC对肝癌组风险度降低,CC基因型和C等位基因对三个肝病组的风险度均有降低的趋势.分析-1082/-819单倍型在各组中的分布,以健康组和自愈组为对照,AC单倍型对肝硬化和肝癌组的风险度均降低,且与自愈组对照时降低程度更大;以自愈组为对照,GC单倍型对慢乙型肝炎和肝硬化组的风险度降低.在不同临床特征的组别之间比较发现,对于-819位点,DNA<103拷贝/mL的患者C等位基因频率显著高于DNA≥103拷贝/mL患者(P=0.025).而在肝癌和肝硬化组的211例不同Child-Pugh肝功能分级、277例不同AFP水平以及所有患者组的389例不同HBsAg表达之间的比较无统计学差异.结论:IL-10-1082AG基因型和G等位基因,-819TC、CC基因型和C等位基因,-1082/-819AC、GC单倍型对HBV感染后疾病进展可能有一定的保护作用,-819位点C等位基因更有利于HBV感染患者病毒的清除.

人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养

目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法。方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式检测内皮细胞特异性表达。结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变。流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达。镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞。结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与HBV感染后疾病转归的关系

目的:探讨MTHFR C677T多态性对HBV感染后疾病转归的关系.方法:采用TaqMan SNP基因分型和基因测序的方法检测152例健康对照人群、161例感染HBV后自愈者、173例慢性乙型肝炎患者、138例乙型肝炎肝硬化患者以及181例HBV相关性肝癌患者的MTHFR基因C677T位点的基因型及等位基因的分布及其差异.结果:805例研究对象的基因型分布为CT基因型占47.09%、TT占30.43%、CC占22.48%;等位基因频率:C为46.02%,T为53.98%,此结果明显不同于以往报道.等位基因和基因型分布在各肝病组无统计学差异.分析不同性别在各组中的分布特征表明,男性患者TT在各组中显示风险降低,特别在肝硬化组TT和CT的OR值最低(与自愈组比较:0.675,95%CI:0.308-1.479;0.510,95%CI:0.248-1.050);而在女性的自愈、慢乙型肝炎和肝硬化组,TT和CT显示风险度增加,特别在肝硬化组OR值最高(与自愈组比较:3.542,95%CI:0.885-14.171;3.167,95%CI:0.821-12.211),具有统计学差异(P=0.022).同时,在女性肝癌组却显示风险度降低(0.638,95%CI:0.213-1.904;0.500,95%CI:0.175-1.432).结论:本研究显示MTHFRC677T多态性在中国天津汉族人中显示了较高的TT基因型频率,同时提示MTHFRC677T多态性在HBV感染后疾病发展的过程中发挥重要作用.

丹参酮ⅡA对肝癌细胞系SMMC-7721去甲基化作用的研究

目的:探讨丹参酮ⅡA对肝癌细胞SMMC-7721抑癌基因的去甲基化作用。方法:将肝癌细胞系SMMC-7721分组培养,丹参酮组和5-氮-2’脱氧胞苷组分别在培养液中加入上述两种药物,阴性对照组不加药物。经培养后,应用甲基化特异性PCR方法检测细胞TFPl2、SPARC、DKK3、p16、APC、MGMT基因启动子区的甲基化状态。应用亚硫酸盐修饰测序法对培养后3组细胞提取的DNA进行测序,比较各组细胞SPARC基因启动子区CpG位点的甲基化差异。通过逆转录PCR、免疫细胞化学染色检测基因的表达。结果:TFP12、p16及APC在SMMC-7721细胞中呈部分甲基化状态,而SPARC、DKK3及MGMT呈完全甲基化状态。经丹参酮ⅡA或5-氮-2’脱氧胞苷作用后,两组细胞SPARC、DKK3及MGMT基因可检测到非甲基化状态,逆转录PCR可检测到这些基因的mRNA表达,免疫细胞化学染色可检测到SPARC的蛋白表达,而对照组细胞未检测到相应基因表达。对SPARC的亚硫酸盐修饰测序显示,对照组、5-氮-2’脱氧胞苷组和丹参酮组细胞的CpG甲基化频率分别为96.53%(139/144)、18.75%(27/144)和45.14%(65/144),各组间比较均有统计学差异(P<0.001)。定量逆转录PCR检测DNA甲基转移酶Ⅰ的相对表达,丹参酮组较对照组下调至36%～78%。结论:丹参酮ⅡA可逆转SMMC-7721细胞部分抑癌基因的甲基化状态,恢复基因表达,其可能通过下调DNA甲基转移酶Ⅰ的表达而影响细胞DNA的甲基化过程。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝穿刺活检标本中鉴别诊断的意义

目的:探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在肝细胞癌(HCC)等不同肝病组织中的表达情况及其对肝癌早期诊断的意义.方法:采用免疫组织化学方法检测126例肝穿刺活检标本(包括13例极早期HCC、44例早期HCC、16例不典型增生、29例肝硬化和24例肝炎)及57例中晚期HCC手术标本中GPC3和甲胎蛋白(AFP)的表达,28例正常肝组织作对照.结果:GPC3在HCC与其他组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.01).GPC3和AFP对HCC诊断的敏感性分别为80.7%和37.7%,特异性分别为99.4%和93.6%.在极早期和早期肝癌中,GPC3的阳性表达率,显著高于AFP(92.3%vs38.5%;72.7%vs34.1%,均P<0.05).GPC3在极早期和早期肝癌中的表达均高于高级别不典型增生组(P<0.01).在肝硬化、肝炎、正常肝组织中均未见GPC3和AFP蛋白表达.GPC3在小肝癌中的阳性率为78.6%,联合AFP可将诊断敏感性提高为85.7%.在血清AFP阴性的小肝癌中GPC3的阳性率高达70%.GPC3阳性表达患者肝癌根治术后1年、2年、3年的复发率明显高于GPC3阴性患者(P<0.05).结论:GPC3在极早期和早期HCC中具有良好的敏感性和特异性,有望成为新的肝癌早期诊断标志物,肝穿刺活检行GPC3染色是一个有效的肝癌早期鉴别诊断的辅助工具,同时也有助于预测HCC患者的预后.

APC和CDKN2A基因甲基化定量分析对肝细胞癌的诊断价值

目的:系统分析基因甲基化在肝癌发生中涉及的分子途径,从中选取代表性基因进一步分析其甲基化在细胞癌变过程中的生物学及临床意义.方法:对10年间关于肝癌基因甲基化相关文献进行数据发掘与功能分类,在其中2个与肝癌发生相关的生物途径中选取APC和CDKN2A基因,采用实时定量甲基化特异性PCR技术对46例成对肝癌与癌旁组织中基因的甲基化水平进行定量分析并评估其诊断价值.结果:生物信息学分析显示肝癌中发生甲基化的基因主要涉及Wnt/β-catenin、p16及p533个主要分子途径;甲基化分析表明CDKN2A基因在肝癌组织中甲基化水平极显著高于癌旁组织(P<0.0001),并且癌组织中甲基化程度在高龄患者中较高(P=0.0027);ROC曲线分析表明通过CDKN2A甲基化定量分析能够高效区分癌与非癌组织(AUC=0.8526).APC基因在癌与癌旁间总体甲基化水平无显著性差异(P=0.0656).结论:CDKN2A基因甲基化水平的升高在肝细胞癌变过程中可能具有重要作用,其甲基化水平的升高可作为一种鉴别癌与非癌组织的分子标志物.CDKN2A甲基化模式的特异性使其在肝癌早期筛查和诊断中具有一定的临床应用价值.