利用CRISPR/Cas9技术创制高油酸甘蓝型油菜新种质

在低硫苷低芥酸的双低甘蓝型油菜基础上,培育稳定的高油酸油菜是当前重要的育种目标之一,本研究通过利用CRISPR/Cas9基因编辑对湖南农业大学选育的品种湘油15号(XY15)进行品种改良。BnaFAD2和BnaFAE1是油酸合成不饱和脂肪酸和超长链脂肪酸的两个关键基因。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统与高效油菜转化技术相结合,对甘蓝型油菜XY15的BnaFAD2.A05、BnaFAD2.C05、BnaFAE1.A08和BnaFAE1.C03同时进行基因编辑,获得了7株T0代转基因植株,通过靶基因克隆测序,发现均未发生基因编辑。然而,在T1代植株中发现并检测到了基因编辑的发生,BnaFAD2.A05、BnaFAD2.C05、BnaFAE1.A08和BnaFAE1.C03的总基因编辑效率分别为38.89%、27.78%、22.22%、30.56%。在T2代植株中,筛选到了5株4个靶基因均发生了突变,且无外源基因的突变体材料Cas9-1-12-4、Cas9-1-12-5、Cas9-2-7-11、Cas9-5-5-3、Cas9-6-6-1,它们的相对油酸含量为68.69%、80.16%、75.82%、75.97%、74.37%,相比于野生型XY15(相对油酸含量为62.04%)均有显著提高。

利用CRISPR/Cas9系统定向编辑甘蓝型油菜BnaLCR78基因

分泌信号肽是生物体内的一类重要功能分子。通过生物信息学分析,揭示甘蓝型油菜BnaLCR78基因编码一个由78个氨基酸组成、N端包含分泌信号肽且C端富含半胱氨酸的蛋白,属于富含半胱氨酸的分泌信号肽。为进一步研究该基因的功能,借助农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化方法,利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnaLCR78基因进行编辑,实现定向敲除。本实验共计使用1 200个外植体,经除草剂草铵膦的抗性筛选及对213株抗性苗基因组DNA的PCR检测,获得了26株转基因油菜,转化率约为2.17%,但在T0代并未获得发生了目标基因被编辑的植株。幸运地是从T0自交获得的T1植株中获得基因被编辑了的植株。通过扩增T1代27株转基因油菜靶位点并测序,发现有1株在靶位点2有一个T碱基的插入,其基因型为+1/WT的杂合突变体,说明在T1植株中,基因的编辑效率达到了3.7%。这对后续研究甘蓝型油菜BnaLCR78基因功能的研究提供了帮助。