JCV病毒T抗原诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立

目的利用α-crystallin启动子构建晶状体上皮细胞中JCV T抗原表达转基因鼠,试图建立晶状体自发肿瘤动物模型。方法利用限制性内切酶BclI分离pBSK(pBluescript SK)-T抗原,BamH I同尾连接插入以pBSK为载体的α-crystallin启动子下游,通过NciI酶切电泳分离带有α-crystallin启动子的T抗原核酸序列后显微注射入C57BL/6J小鼠受精卵中。PCR检测转基因阳性鼠及JCV病毒T抗原拷贝数,大体和组织学观察眼球及病变组织,免疫组织化学观察T抗原、p53和β-catenin表达。结果成功构建α-crystallin JCV T抗原表达质粒,转基因阳性鼠中2号鼠(αAT-2)拷贝数最高,该鼠眼球于11个月表现出肿瘤样改变,肿瘤细胞中T抗原、p53和β-catenin呈强阳性表达。结论 JCV T抗原直接诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立为JCV T抗原嵌入所致上皮肿瘤提供了直接实验依据,为JCV所致上皮肿瘤发生和演进分子机理研究奠定坚实基础,同时为抗肿瘤药物筛选及基因治疗监控提供了良好的动物模型。

晶状体自发肿瘤转基因鼠脑横截面标本制备及鉴定

目的确定JCV T抗原诱发晶状体肿瘤转基因鼠脑中肿瘤来源及路径。方法 18月龄转基因鼠麻醉后4%多聚甲醛灌流固定,EDTA脱钙颅骨软化后脑经横截制备石蜡标本并进行HE染色。免疫组化和免疫荧光确定脑组织T抗原表达。结果经过脱钙处理后颅骨组织非常软,横截后发现白色肿瘤组织蔓延至脑组织中,HE染色确定眼部和脑部白色组织均为晶状体肿瘤细胞,免疫组化和免疫荧光结果显示细胞核中存在T抗原强阳性表达。结论 JCV T抗原诱发晶状体肿瘤是经过视神经孔进入脑组织,鼠头横截面组织标本制备对研究头部肿瘤的毗邻关系和肿瘤组织在脑组织中侵袭部位极具应用价值。

胃癌中REIC蛋白分泌水平及其增殖抑制作用研究

目的:研究胃癌患者血清和胃癌细胞培养液上清中分泌型REIC含量及重组REIC对胃癌细胞增殖的影响。方法:ELISA检测血清和细胞上清中的REIC表达;WST-8法检测胃癌细胞的增殖。结果:REIC在胃癌患者中的分泌水平比正常健康人明显降低(P<0.05),并且与肿块大小呈负相关(P<0.05);胃癌细胞系培养液上清中的REIC表达低于正常的胃黏膜细胞(P<0.05);胃癌AGS细胞系转染REIC后,细胞培养液上清中的REIC浓度升高(P<0.05);加入外源性融合的REIC可以抑制胃癌细胞AGS和BGC-823的增殖(P<0.05)。结论:分泌型的REIC在胃癌细胞中表达降低,重组REIC蛋白可抑制胃癌细胞的增殖,REIC蛋白可以作为胃癌早诊、生物学和基因治疗的靶点。

胃黏膜特异表达JC病毒T抗原质粒构建及表达鉴定

目的利用鼠胃黏膜上皮细胞中高活性的角蛋白19(K19)启动子构建K19-JCVT抗原表达质粒并进行鉴定。方法利用PCR方法突变JC病毒T抗原中的NdeⅠ位点,并在两端插入BclⅠ位点,通过BamHⅠ位点将DNA片段与K19启动子连接,构建K19-JCVT抗原质粒。利用酶切和DNA测序确认其DNA序列。免疫组化筛选细胞角蛋白19阳性胃癌细胞,对细胞角蛋白19表达阳性的胃癌细胞系AGS进行K19-JCVT抗原质粒转染,用Western blot方法检测JCVT抗原的表达情况。结果K19-JCVT抗原表达质粒成功构建,AGS胃癌细胞系高表达细胞角蛋白19并用于K19-JCVT抗原表达质粒转染,转染K19-T抗原质粒的AGS细胞系有T抗原表达。结论同义突变和相似连接在质粒构建中起到关键作用,酶切位点的甲基化也是值得注意的问题。

Akt及磷酸化Akt308和473在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的:探讨Akt及磷酸化的Akt在人结直肠癌的发生和演进中的作用。方法:应用组织芯片结合免疫组化染色方法检测323例结直肠癌和107例对应的非癌粘膜组织中Akt、苏氨酸308位点磷酸化的Akt(pAkt308)和丝氨酸473位点磷酸化Akt(pAkt473)的表达和结直肠癌临床病理参数的关系,并分析三者以及VEGF和Ki67表达的相关性。结果:结直肠癌中Akt、pAkt308和pAkt473的阳性率分别为63.2%、64.7%、72.4%,在非癌粘膜组织中分别为37.4%、13.1%、16.8%。结直肠癌中三者的表达显著高于癌旁正常粘膜的表达(P<0.001)。肿瘤中Akt和pAkt473表达与肿瘤高分化具有统计学相关性(P=0.027,P=0.039),但与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴管或静脉转移、淋巴结转移及Duke's分期无关(P>0.05)。pAkt308表达与淋巴结转移相关(P=0.017),但与其他临床病理参数无关(P>0.05)。而且,Akt表达与Akt308,pAkt473,VEGF和Ki67表达均有统计学相关性(P<0.01)。结论:在结直肠癌发生过程中,Akt、pAkt308和pAkt473表达明显上调。pAkt308是预示肿瘤演进和预后的良好指标,pAkt308和pAkt473可能是有效的结直肠癌的分子治疗新靶点。

胃癌组织中ATBF1蛋白的表达及临床病理意义

目的观察胃癌发生和演进过程中ATBF1蛋白表达的作用及相关机制。方法福尔马林固定、石蜡包埋的胃癌及癌旁黏膜标本制作成组织芯片,制备4种ATBF1抗体(NT440、1-12、D1-120和AT6)后进行免疫组化反应,检测胃癌中ATBF1蛋白表达,并比较其与胃癌临床病理特征和ki-67表达的关系。结果胃癌中细胞质NT440和AT6阳性表达率低于癌旁黏膜(P<0.05),但细胞核NT440的表达与其相反(P<0.05)。老年胃癌患者中D1-120和AT6的阳性表达率高于年轻患者(P<0.05),D1-120和AT6表达与胃癌淋巴结转移或局部脉管侵袭呈正相关(P<0.05)。值得注意的是,胃癌中1-12和ki-67阳性表达水平呈正相关(P<0.05)。结论胃癌发生和演进中异常ATBF1表达及核质转位发挥重要作用,ATBF1表达通过调节细胞增殖参与胃癌局部脉管侵袭和淋巴结转移。

胃肠道癌Parafibromin蛋白的表达及其与临床病理特征和预后的关系研究

目的：检测胃肠道癌组织中Parafibromin蛋白的表达，并探讨其与临床病理特征和预后的关系。方法选取1997年12月-2008年12月日本富山大学医学部手术切除并经病理证实为胃肠道癌的患者814例。收集所有胃肠道癌患者癌组织标本814份，同时收集胃肠道癌患者癌旁组织标本328份及腺瘤组织标本129份。采用免疫组织化学法检测胃肠道癌组织、癌旁组织和腺瘤组织中Parafibromin蛋白的表达情况；并对胃肠道癌患者进行生存分析和死亡危险因素的Cox回归分析。结果 Parafibromin蛋白表达阳性率在胃肠道癌组织中为48.9%（398/814），低于腺瘤组织及癌旁组织的78.3%（101/129）和92.7%（304/328），差异有统计学意义（χ2=189.20、47.50，P〈0.05）。Spearman等级相关分析显示，Parafibromin 蛋白表达阳性与肿瘤直径、淋巴管侵袭、淋巴结转移、UICC 分期呈负相关（ rs=-0.198、-0.134、-0.238、-0.244，P 〈0.05），与性别、年龄、静脉侵袭无相关性（ rs =0.055、0.039、-0.048，P〉0.05）。电话随访573例胃肠道癌患者，失访241例，生存时间为0.2-146.4个月，平均42.1个月。生存分析显示，Parafibromin蛋白表达阴性患者累积生存率低于Parafibromin蛋白表达阳性患者（χ2=32.60，P〈0.05）。Cox回归分析显示，年龄≥60岁〔OR（95%CI）=1.589（1.194，2.113）〕、肿瘤直径≥4.5 cm〔OR（95%CI）=1.407（1.037，1.908）〕、有淋巴管侵袭〔OR（95%CI）=1.925（1.445，2.565）〕、有淋巴结转移〔OR（95%CI）=2.621（1.867，3.679）〕、UICC分期Ⅲ-Ⅳ期〔OR（95%CI）=1.564（1.067，2.292）〕是胃肠道癌死亡的独立危险因素（P〈0.05），而Parafibromin蛋白表达阳性〔OR（95%CI）=0.611（0.463，0.806）〕是胃肠道癌死亡的保护因素（P〈0.05）。结论 Parafibromin蛋白表达降低与胃肠道癌的发生、侵袭和转移有关，且与胃肠道癌患者的预后密切相关，Parafibromin蛋白可作为潜在的胃肠道癌预后指标，为今后的临床研究提供参考价值。

头颈部鳞癌中α-catulin表达的临床病理和预后意义

目的细胞骨架连接蛋白α-catulin是Rho信号通路组件之一,在癌细胞凋亡、抗衰老、细胞骨架重组、迁移、侵袭和上皮细胞间质转化(EMT)过程中发挥重要作用。探讨头颈部鳞癌中α-catulin表达的临床病理和预后意义。方法采用免疫组化方法检测α-catulin在头颈部鳞状上皮癌(HNSCC)组织芯片中的表达,分析其和临床病理学特征及生存率的关系。结果α-catulin在HNSCC原发癌中的表达比正常和异型增生的鳞状上皮细胞显著增高(P<0.05),但是和HNSCC的恶性生物学行为和不良预后无明显相关(P>0.05)。Cox比例风险回归分析结果显示远处转移和TNM分期是HNSCC的独立预后因素(P<0.05)。结论上调α-catulin的表达在HNSCC病因学上具有重要意义,可作为研究HNSCC肿瘤发生的分子靶标。

地高辛标记核酸病理形态学检测方法的建立及应用

目的建立地高辛标记原位杂交(ISH)和原位PCR(ISP)方法,探讨其在病理形态学检测中的应用。方法以细胞cDNA或质粒DNA为模板制备地高辛探针,ISH检测肺癌、胃癌或结直肠癌切片上JCV T抗原DNA、beclin 1和SERCA3 mRNA表达水平。在肺癌和胃癌切片上扩增地高辛标记的JCV T抗原DNA。杂交或标记后,进行抗地高辛碱性磷酸酶反应并行NBT/BCIP或Fuchsin显色。结果 PCR扩增获得高纯度地高辛标记DNA探针,甲酰胺杂交液杂交显示JCV T抗原存在于JCI细胞的细胞核中,beclin 1和SERCA3 mRNA阳性信号见于结肠癌和癌旁黏膜上皮细胞质中。ISP扩增了地高辛标记的JCV T抗原DNA,显色后发现JCV T抗原主要定位在JCI细胞、肺泡上皮细胞和肺癌细胞核、胃癌及癌旁黏膜细胞核中。NBT/BCIP显色比Fuchsin显色更为敏感,甲基绿复染使得上述2种显色更加清晰。结论地高辛标记的ISH和ISP操作简便,敏感度高,NBT/BCIP显色和甲基绿复染图像美观。

胃癌组织及细胞株细胞骨架蛋白Fascin-1表达临床意义分析

目的:分析胃癌组织及细胞株中Fascin-1蛋白表达的临床病理及预后意义。方法:从日本理化研究所获得胃癌细胞株MKN28、AGS、MKN45和KATO-Ⅲ。收集日本富山大学医学部1993-02-01-2006-10-01胃癌组织455例。利用实时PCR、蛋白质印迹法杂交或免疫组化检测胃癌细胞株(MKN28、AGS、MKN45和KATO-Ⅲ)和胃癌组织中Fascin-1mRNA和蛋白的表达,分析胃癌组织中Fascin-1蛋白表达与临床病理特征和预后的关系。结果:Fascin-1蛋白主要定位在胃癌细胞株的细胞质中,在MKN28和MKN45细胞株中呈强表达,在AGS和KATO-Ⅲ细胞中弱表达。胃癌组织中Fascin-1mRNA表达水平显著高于癌旁正常黏膜组织,t=5.267,P<0.001;Fascin-1蛋白表达与胃癌肿块大小(rs=0.116,P<0.001)、侵袭深度(rs=0.177,P<0.001)、淋巴管侵袭(rs=0.190,P=0.005)、静脉侵袭(rs=0.131,P=0.003)、淋巴结转移(rs=0.141,P=0.013)和TNM分期(rs=0.174,P<0.001)呈正相关。Cox风险比率回归模型显示,年龄(P<0.001)、侵袭深度(P<0.001)、淋巴管侵袭(P<0.001)、淋巴结转移(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)和Lauren分型(P=0.003)为独立的预后因素。结论:Fascin-1蛋白表达在胃癌细胞株的侵袭转移过程中发挥重要作用,Fascin-1蛋白表达上调参与胃癌发生和演进过程,可以作为胃癌恶性程度和预后判断的有效分子标志。

JC病毒T抗原诱发肺肿瘤转基因动物模型检测

目的:利用细胞角蛋白19(K19)启动子构建胃黏膜上皮细胞中JC病毒(John Cunningham virus,JCV)T抗原表达转基因鼠,试图建立胃黏膜自发肿瘤动物模型。方法:利用限制性内切酶NdeⅠ,酶切K19-JCV T抗原表达质粒,电泳分离带有K19启动子的T抗原核酸序列后,显微注射入C57BL/6J30只小鼠受精卵中。PCR检测转基因阳性鼠,组织学观察主要脏器的形态学表现及免疫组化检测T抗原表达。结果:显微注射K19-JCV T抗原(KT)DNA片段后成功获得11种转基因阳性鼠,其中2个月龄KT7的各脏器组织学检测显示,脑、肝、肾、食管、前胃、胃、小肠、大肠、胰腺、肺、心脏和脾组织未见异常形态学改变,JCV T抗原特异表达于胃黏膜上皮细胞和支气管上皮细胞的细胞核中,16个月龄的KT7转基因鼠13.3%(2/15)出现肺肿瘤和腺癌的病理学改变,T抗原定位于癌细胞细胞核中。结论:JCV T抗原直接诱发肺肿瘤动物模型的建立为JCV T抗原嵌入所致上皮肿瘤提供了直接的实验依据,为JCV所致上皮肿瘤发生和演进分子机制奠定基础,同时为抗肿瘤药物筛选及基因治疗监控提供了良好的动物模型。

胃癌组织芯片快速制备及Reg Ⅳ编码产物检测

目的:建立快速胃癌组织芯片(tissue microarray,TMA)制作方法,探讨其在RegⅣ编码产物检测和研究中的应用。方法:收集日本富山大学医学部1993-04-20-2010-11-29胃癌石蜡标本372例和相应癌旁黏膜标本(距离癌组织>4cm)198例,应用AZUMAYA芯片机构建48阵列组织芯片,利用免疫组化和原位杂交检测RegⅣ蛋白和mRNA的原位表达。在Olympus BX41显微镜下选定切取部位,利用2mm的穿刺针切除供体蜡块,不用制备受体蜡块,直接将切除组织放入金属包埋皿的固定盒上制备48阵列芯片。结果:组织芯片经HE染色确定了组织病理学诊断,免疫组化和原位杂交均发现在肠上皮化生和黏液分泌性肿瘤细胞质中存在RegⅣ蛋白和mRNA表达。胃黏膜肠化生中RegⅣ蛋白表达为100%(63/63),高于胃炎的29.0%(27/93,χ2=73.67,P<0.001)、腺瘤的85.7%(36/42,χ2=9.54,P<0.005)和胃癌的45.2%(168/372,χ2=65.06,P<0.001)。胃癌组织中,印戒细胞癌阳性率为95.3%(41/43),高于低分化癌的27.4%(32/117),χ2=55.89,P<0.001。原位杂交发现,癌旁黏膜肠化生上皮细胞中RegⅣmRNA表达阳性率为95.2%(40/42),高于癌旁正常黏膜的38.6%(17/44,χ2=30.63,P<0.001)和胃癌的20.3%(14/69,χ2=55.74,P<0.001)。结论:制备TMA不需要制备受体蜡块,提高了TMA制作速度。异常RegⅣ表达与胃黏膜肠化生-球样异型增生-印戒细胞癌的发生途径关系密切。