大肠杆菌K5多糖生物合成条件的优化

采用Plackett-Burman实验、正交试验设计方法对K5多糖的生物合成条件进行优化。然后,在摇瓶及5 L发酵罐中进行K5多糖发酵过程研究。结果表明:最佳培养基组成为麦芽糖20 g/L,蛋白胨15 g/L,MnCl4·4H2O0.1 g/L,MgSO4·7H2O 2.0 g/L,KH2PO42.0 g/L,K2HPO49.7 g/L,脱水枸橼酸钠0.5 g/L;250 mL摇瓶最佳装液量为15 mL。优化后5 L发酵罐中K5多糖的质量浓度为1.8 g/L,较优化前的0.3 g/L提高了5倍。

K5裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

K5多糖裂解酶(Elma)能够裂解半合成肝素的底物-K5多糖,裂解产物是半合成法生产低分子量肝素的底物。利用PCR方法扩增elma,构建表达载体pET-28a-Elma,将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21中,以0.2 mmol/L的IPTG在16℃诱导5 h实现了高效表达,SDS-PAGE分析表明Elma表达量可达菌体总蛋白的30%以上。采用Ni2+-NTA亲和层析法和G-75分子筛层析纯化目的蛋白,其纯度大于95%。通过PAGE多糖电泳发现裂解前后的K5多糖分子量有明显的减小。根据Elma裂解产物产生双键从而在232 nm处有吸光度的变化来测Elma的酶活。其最适反应温度为37℃,反应的最适pH值为7.0。底物特异性分析发现Elma除K5多糖外对肝素和透明质酸也有降解作用。