非生物胁迫对金龙胆草主要成分积累的影响及隶属函数分析

[目的]以中草药金龙胆草(Conyza blinii H.Lév)为材料,研究不同非生物胁迫对其重要次生代谢物含量的影响,为高品质金龙胆草的育种提供参考。[方法]采用模拟非生物胁迫盆栽试验的方法,检测高盐、低温、干旱、紫外和茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫后金龙胆草皂苷、苦蒿素和黄酮含量的变化,利用隶属函数分析法评价不同非生物胁迫的效果。[结果]在各非生物因素胁迫下3种次生代谢物含量均呈增加趋势,其中紫外胁迫对皂苷和苦蒿素含量积累作用较明显,胁迫48 h皂苷含量增加了1.06倍,苦蒿素含量增加了0.43倍,而对黄酮含量影响较大的为茉莉酸甲酯,胁迫48 h黄酮含量增加了3.68倍。隶属函数分析显示,5种胁迫的效果由强到弱为紫外>茉莉酸甲酯>低温>高盐>干旱。[结论]利用非生物胁迫选育高次生代谢物含量的金龙胆草植株是可行的,且紫外胁迫为最优选择。

野生金龙胆草遗传多样性的RAPD分析及总黄酮成分在局群间的分布特征

探索来自18个采集地的金龙胆草RAPD遗传性分析及总黄酮成分在局群间的分布特征。采用筛选的10个随机引物,用NTSYSpc2.1软件计算材料间的Jaccard遗传相似系数(GS),并建立各种间的亲缘关系树形图,并利用紫外分光光度法测试各样品中总黄酮的含量。10个引物共扩出71个DNA片段,多态性DNA片段68个,占总扩增数的97.14%。18个金龙胆草种源可明显聚为2大类。总黄酮含量以攀枝花市范围的样品含量最高。不同种源金龙胆草间具有丰富的遗传多样性,总黄酮含量分布却与遗传聚类的分类有差异,提示今后在金龙胆草选育和道地药材研究上应该从多方面进行考虑。

金龙胆草SRAP银染反应体系的建立与优化

建立适宜金龙胆草DNA的SRAP-PCR扩增体系,为金龙胆草分子标记打下基础。针对常规银染方法从是否固定、银染液组成、银染时间、显影液组成等方面优化了金龙胆草SRAP扩增产物的检测方法,同时探索了金龙胆草SRAP-PCR反应程序,并对金龙胆草SRAP-PCR反应体系的各影响因子进行优化。结果建立了一个银染步骤快速、高效的银染检查方法,筛选的退火温度为51.3℃,最佳SRAP-PCR反应体系(15μL)为:DNA 40 ng,引物浓度0.7μmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Mg2+1.9 mmol/L,Taq聚合酶0.6 U,10×buffer 2μL,双蒸水补足。该程序和体系能很好地满足金龙胆草基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于金龙胆草遗传研究是可行的。

鸡蛋花对干旱胁迫的生理响应试验初报

为了寻找适宜旱区种植的植物,以鸡蛋花为实验材料,采用盆栽控水模拟干旱,设置正常、低旱、中旱和重旱4个水分梯度,通过测定叶绿素、渗透调节物质、膜脂过氧化物含量及抗氧化酶活性变化,分析其对干旱胁迫的生理响应,为其在干旱地区推广应用提供参考。结果表明,1)随着干旱胁迫程度的加强,鸡蛋花叶片叶绿素含量呈下降趋势,而游离脯氨酸(Pro)、可溶性糖、丙二醛(MDA)含量逐渐增加,重旱时分别为对照组的1.37、1.47、1.44倍。2)超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性逐渐升高,为对照组的2.04、2.44、2.25倍。3)鸡蛋花通过增加渗透调节物质含量和提高抗氧化酶活性等方式来响应干旱胁迫,具有较强的抗旱能力,可在干旱地区推广应用。

三角梅CHS基因的克隆及表达分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)为花青素苷合成途径的关键酶,是观赏植物花色改良分子育种的研究热点。随着生物技术的发展转录组测序技术成为快速克隆新基因的有效手段,以‘新加坡大白’三角梅苞片转录组数据库为基础,筛选克隆CHS基因,利用生物信息学方法预测分析其蛋白的结构与功能,通过实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同花色三角梅中的表达模式。结果表明:获得的CHS基因cDNA全长1176 bp(GenBank ID:MT302539),编码一个43.96 ku的蛋白,定位于细胞质中,含有CHS特征基序及活性位点,三级结构预测显示为二聚体蛋白,系统进化树分析结果显示与同为中央种子目的植物亲缘关系较近,符合系统进化关系。qRT-PCR显示该基因在黄色叶片中的表达量是红色叶片的24倍,表明黄色更适用于花青素途径的研究。研究结果为三角梅花色改良基因转化受体的筛选提供参考。

三角梅黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及表达分析

为探究三角梅产生飞燕草素的可能性,根据前期获得的三角梅转录组数据,克隆花青素合成途径关键酶黄烷酮3-羟化酶基因(flavanone 3-hydroxylase,F3H),并通过荧光定量PCR技术检测其在不同颜色三角梅叶片及苞片中的表达量差异。结果显示成功克隆获得了一条cDNA全长1 089 bp,编码363个氨基酸的基因序列,将其命名为BsF3H,登陆GeneBank(OL957093)。BsF3H相对分子质量为41.14 kD,理论等电点为5.48,含有2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶结构域,不具有信号肽及跨膜结构,细胞定位于细胞质中,最多的二级结构为α螺旋,三级结构预测显示为单体蛋白。RT-qPCR结果显示该基因在不同颜色三角梅中表达量均不高,相对而言在紫色安格斯(Elizabeth Angus)苞片中表达量最高。研究结果表明三角梅具有产生各类花青素的潜力,可利用基因工程手段对其颜色进行改造。

三角梅cDOPA 5GT基因的克隆和光照对其表达的影响

为了解光照对三角梅(Bougainvillea glabra)葡糖基转移酶基因表达的影响,从其苞片中克隆了环多巴5-糖基转移酶基因(cDOPA 5GT)。结果表明,三角梅cDOPA 5GT基因的cDNA全长为1446 bp,编码482个氨基酸,生物信息学分析表明cDOPA 5GT蛋白的等电点(PI)为5.77,具有糖基转移酶的特征基序,为酸性亲水跨膜蛋白,不含信号肽,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,氨基酸序列保守性较差。qRT-PCR分析表明,遮光处理cDOPA 5GT基因表达量和植株的甜菜红素含量均显著下降。这表明三角梅的色素合成受糖基转移酶基因调控,并与光照呈正相关关系。

一种快速检测抗菌肽与饲用抗生素协同抑菌关系的方法

虽然抗菌肽是具有广谱杀菌作用的免疫分子,但仍不能完全取代抗生素,由于抗菌肽和抗生素的抗菌机制不同,他们间的联合使用是目前主要的研究内容。研究旨在通过牛津杯法快速判断抗菌肽产品与5种抗生素间联合抑菌关系,同时研究不同革兰阴性微生物对联合抑菌的影响。试验结果表明:牛津杯法可快速检测出抗菌肽与抗生素间的协同作用关系,且受不同条件的影响小,但协同作用的抑菌能力会受微生物的影响。

金龙胆草3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的对金龙胆草Conyza blinii 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因进行克隆及序列分析,并检测其是否可作为金龙胆草的内参基因。方法采用RACE技术克隆金龙胆草GAPDH基因的cDNA全长序列,利用DNAMAN、BLAST、MEGA等工具对序列进行生物信息学分析,并以其为内参进行半定量RT-PCR。结果克隆获得了1个全长1 418 bp的GAPDH基因,完整开放阅读框1 020 bp,编码340个氨基酸,命名为GLGAPDH。序列比对结果显示,金龙胆草的GAPDH基因与紫背天葵的同源序列相似性达到96%,与薇甘菊的同源序列相似性为93%。通过系统进化树分析发现其与紫背天葵的亲缘关系最近。半定量RT-PCR分析GLGAPDH作为内参基因在不同组织中表达稳定,扩增效果良好,重现性强。结论首次克隆了金龙胆草GAPDH基因的全长cDNA序列,并通过半定量实验验证了其可作为内参基因用于基因表达量分析,为金龙胆草次生代谢物合成过程中关键酶表达分析及调控机制的研究奠定了基础。

金龙胆草研究进展

金龙胆草Conyza blinii为我国川滇黔地区的一种道地中药材,具有清热解毒、止咳平喘的功效,主要用于治疗慢性支气管炎引起的咳嗽及其他炎症。整理金龙胆草国内外文献报道,对其资源分布、化学成分、药理作用、遗传多样性、次生代谢物合成途径及应用等方面的研究进展进行综述,为该药材的资源开发利用及新药产品的研发提供参考。

金龙胆草油菜素内酯合成途径C-23羟化酶基因的克隆及分析

油菜素内酯具有促进植物生长、增加产量和提高植物抗逆性等作用。本研究以中草药金龙胆草(Conyza blinii)为研究对象,克隆分析其油菜素内酯合成途径C-23羟化酶(CYP90C1/ROT3)基因。根据金龙胆草叶片转录组数据,克隆获得了一条全长1512 bp的ROT3基因cDNA序列,编码504个氨基酸,命名为CbROT3,GenBank登录号为KX907782;通过生物信息学工具分析其分子特征表明CbROT3氨基酸序列与向日葵(Helianthus annuus)ROT3的相似性达87%,系统进化树分析结果也与之相吻合;该基因蛋白相对分子质量为57.51 kD,等电点为7.59,为亲水性蛋白,具有一个跨膜结构,无信号肽序列;摸索其原核表达条件,发现在22℃、0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导条件下可获得最大量的可溶性目的蛋白。本研究结果对提高金龙胆草内源油菜素内酯含量,调控金龙胆草生长发育和增加金龙胆草抗逆性提供理论依据。