渤海海域低温GOD菌株筛选及鉴定

海洋微生物来源的葡萄糖氧化酶通常具有低温或常温下高催化活性的特点,在食品及饲料工业中具有广泛的应用。笔者所在项目组利用平板显色法,从大连渤海海域的海泥和海鱼中分离产低温葡萄糖氧化酶的微生物,经摇瓶发酵法测定各菌株的产酶能力,最终通过菌株的形态学特征和生理生化特征进行初步鉴定。该实验共筛选得到了具有产低温葡萄糖氧化酶能力的菌株6株,其中细菌2株、酵母菌2株和霉菌2株。产葡萄糖氧化酶的酶活力最高的菌为编号5-7霉菌,其酶活力为0.904 U/mL;产葡萄糖氧化酶的酶活力最低的菌为编号2-4酵母菌,其酶活力为0.135 U/mL。通过形态学及生理生化特征鉴定,初步确定了具有产低温葡萄糖氧化酶能力的两株细菌的分类:细菌8-2可能为假单胞菌属,细菌8-3可能为分枝杆菌属。该研究发掘了潜在的低温葡萄糖氧化酶生产菌株,为今后葡萄糖氧化酶的工业化生产及应用奠定了前期研究基础。

南沙链霉菌来源细胞色素P450酶CYP154C34的表征及生物转化

【目的】P450酶作为一种多功能生物催化剂,可在温和条件下高区域和立体选择性地催化复杂化合物中未活化的C-H键,因此P450酶在化工原料合成、环境污染物降解及药物合成等领域都具有重要作用。本文对南沙链霉菌基因组中的一个新颖的P450酶CYP154C34进行研究,通过构建异源表达和全细胞生物转化重组菌探究其功能。【方法】构建2种全细胞生物转化BL21(DE3)重组菌(含p ET28a-CYP154C34-RhFRED和pET28a-CYP154C34+pACYCDuet-Pdx/PdR)和1种异源表达BL21(DE3)重组菌(含pET28a-CYP154C34)。通过全细胞生物转化的方式筛选底物,分析催化功能及产物结构。比较2种全细胞生物转化重组菌和体外酶反应对底物的转化率。分析CYP154C34和不同底物及底物类似物的亲和力。【结果】通过底物筛选和产物鉴定发现CYP154C34可催化包括孕酮、睾酮、雄烯二酮在内的9种甾体化合物16α位羟基化。通过2种不同还原伴侣的全细胞体系及体外酶反应对底物转化率的比较,发现含有pET28a-CYP154C34-RhFRED的BL21(DE3)重组菌的转化率最高,可对孕酮、睾酮、雄烯二酮等7种底物实现超过90%的转化率。通过亲和力分析发现CYP154C34对底物化合物的亲和力比类似物高。【结论】本研究构建了2种CYP154C34的全细胞生物转化重组菌并鉴定其功能。CYP154C34催化的底物谱宽并且具有极高的区域和立体选择性及较高的转化率,具有良好的工业应用前景。