CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)是一种微生物获得性免疫系统,自从证实其可用于基因编辑之后,迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力,为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力,快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而,CRISPR/Cas系统也有一些固有的问题,例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序(PAM)对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等,严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展,阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制,“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的Ⅱ类CRISPR/Cas系统,重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制,及其在结构改造和功能拓展等方面的新进展,同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述,例如CRISPR/CasФ和CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题,有力地拓展了其功能和适用性,势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。

维生素C二步发酵过程动力学模型的研究

本文系统地分析了L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸的生物转化过程,提出了生长因子的假定,对发酵机理进行了新的探讨,对发酵过程做了必要与合理的简化。首次建立了维生素C第二步发酵过程的动力学模型。运用多面体最优化法和Runge-Kutta积分法等数学方法处理模型,获得最佳模型参数。结果表明,模型计算值与实验值得到良好的吻合,从而证明动力学模型是正确的和有效的。

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 p H分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn2 +、Fe3 +、Cu2 +抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β- D糖苷键具有高度专一性 ,与糖苷键相连的配基对酶活力也有很大影响。在 55℃ ,酶作用于底物 ONPG和乳糖的米氏常数 Km分别 2 .6 3mmol/L和 4 .93mmol/L,最大反应速度分别为 1.93× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein和 6 .54× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein。乳糖的水解产物葡萄糖抑制酶活力 ,其抑制常数 2 .4 7mmol/L ,但半乳糖没有这种效应。另外 ,该酶具有转半乳糖苷的活力 ,在水解乳糖过程中 ,生成包括三、四糖的半乳糖低聚糖。

固定化嗜热脂肪芽孢杆菌连续合成半乳糖寡糖的研究

利用固定了产 β 半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢杆菌 ,以乳糖为底物 ,在纤维床反应器中连续合成半乳糖寡糖 (GOS) ,最高得率为 5 0 7%。在连续反应体系中 ,研究了底物浓度、pH、反应温度和停留时间对半乳糖寡糖合成的影响 ,确定最佳反应条件为底物浓度 45 0 g/L、反应温度 5 5℃、pH7 0、停留时间 10 0min。在连续反应 2 4h后 ,流加 1 5 %的D 半乳糖能提高合成GOS的能力 ,固定化细胞反应体系中连续稳定操作 12 0h。

增广Kalman滤波器在维生素C二步发酵中的应用

本文在维生素C二步发酵动力学模型研究的基础上,引进增广Kalman滤波器理论,将数学模型、发酵系统和实际操作等因素引起的偏差归为白噪声序列,用于发酵状态及模型参数的滤波处理。结果表明:滤波估计比模型计算的拟合精度大为提高。通过对模型参数的分析,加深了对该系统动力学特性的认识,为维生素C二步发酵过程的状态估计,状态预测及在线辨识奠定了理论基础。

固定化细胞分布对动力学影响的模型化研究

通过对固定化Gluconobacter oxydans和Bacillus cereus的活细胞系统的研究,提出了固定化细胞不均匀分布模型,将此类分布与均匀分布(最劣分布模型)进行比较,分析了它们对固定化细胞内部的基质浓度分布、有效速率因子和选择率的影响,指出不均匀分布和均匀分布对于该固定化活细胞系统的动力学行为无显著影响,这一模型分析结果在实验中得以验证。通过无因次化分析,建立了适用于固定化生物催化剂动力学研究的模型方法。

噬菌体抗体库筛选技术

噬菌体展示技术（PhageDisplayTechnology）为制备高亲和性抗体提供了有力的工具。噬菌体抗体库的筛选是其中关键的环节，为了提高筛选效率，用包被在固体表面的抗原进行筛选的传统方法不断地被改进，如宿主菌直接洗脱和双层膜筛选系统。针对细胞表面抗原等抗原难以纯化因而传统方法不适用的情况，又出现了直接细胞筛选系统和抗抗体替代抗原筛选系统。将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联，产生了选择性感染筛选系统。

利用改进的卡拉胶载体固定化Gluconobacter oxydans和Bacilllus cereus活细胞的研究

本文利用氯化钙和脱乙酰几丁质改进卡拉胶载体用于固定化G.oxydans和B.cereus活细胞取得理想效果.脱乙酰几丁质与卡拉胶可以形成韧性和通透性良好的网络结构,改善了固定化细胞的各种性能.凝胶中的细胞密度可高达3.25×10~3个细胞/ml凝胶,固定化细胞可反复利用11批,每批发酵收率均可维持在65%左右。

胡黄连苷-Ⅱ在体外对PC12神经细胞损伤的保护作用

目的 :考察胡黄连苷 Ⅱ对PC12神经细胞损伤的保护作用。方法 :采用细胞培养的方法 ,建立PC12神经细胞双氧水 (H2 O2 )损伤模型。通过观察细胞形态 ,测定细胞存活率 (MTT法 ) ,乳酸脱氢酶(LDH)漏出率 ,细胞内氧化活性物质 (ROS)水平 ,检测胡黄连苷 Ⅱ对PC12细胞损伤的保护作用。结果 :同造模组比较 ,胡黄连苷 Ⅱ 0 .5、5 .0mmol·L-1能减轻H2 O2 引起的对PC12神经细胞的损伤 ,明显提高细胞的存活率 ,减少LDH的释放量 ,降低细胞内ROS水平。结论 :胡黄连苷 Ⅱ对PC12神经细胞损伤具有明显的保护作用。

大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯固定化酶载体的合成及性能研究

选用反应性单体甲基丙烯酸缩水甘油酯 ,以N ,N′ 亚甲基双 (丙烯酰胺 )为交联剂 ,甲酰胺为致孔剂 ,用反相悬浮聚合方法制得一系列珠状共聚物载体 ,通过测定其表面的物化性能、表面的环氧基浓度和固定青霉素酰化酶活性 ,讨论了交联剂用量、配比及合成条件对共聚物表面性能和固定化青霉素酰化酶活性的影响 .

灵菌红素对有害藻类的除藻活性研究

研究了沙雷氏菌的天然产物灵菌红素对引起海洋赤潮和淡水水华的有害藻类的除藻活性和光解性质.结果表明,5.0μg/mL灵菌红素能够在24h内将新月菱形藻、中肋骨条藻、水华鱼腥藻和微小平列藻培养液中的藻类全部杀死,除藻活性高达100%.5.0μg/mL灵菌红素在30000lx光强下36h完全分解,不会给自然环境带来二次污染.

蜂胶HPLC指纹图谱及质量控制

目的:研究蜂胶HPLC指纹图谱,对蜂胶进行质量控制。方法:采用RP-HPLC测定。结果:不同来源的蜂胶所含黄酮类成分之间的相似性较大,其差异较小。结论:可以采用HPLC指纹图谱,对市场上蜂胶的品种和蜂胶保健品的真伪进行鉴别。

蛹虫草及其培养基中主要核苷类成分的分析比较

采用高效液相色谱法测定虫草中的核苷类成分,优化后的色谱条件为YMC-Polyamine柱(250mm×4.6mm,5μm);采用梯度洗脱,流动相:乙腈-水(V/V):0～15min为90:10,15～20min为86.5:13.5,20～30min为75:25,30～35min为70:30;流速:1mL/min;柱温:30℃;检测波长:259nm;进样量:10μL。结果表明:胸腺嘧啶、虫草素、尿嘧啶、腺苷、腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤均能得到较好分离,该方法稳定性好、精密度高、重现性好,适用于虫草中的核苷类成分的分析。经分析发现,蛹虫草子实体核苷类物质组成大致相似,但含量差异非常显著,同时发现蛹虫草培养基残基及固体发酵产物中虫草素含量较高,其他核苷类成分很少,因此认定蛹虫草培养基残基及固体发酵产物是非常优良的分离纯化虫草素的原料。

原花青素体外清除自由基活性的研究

从葡萄籽中提取高纯度的原花青素 ,测得其对稳定自由基 1 ,1 -联苯 -β-苦基偕腙肼( DPPH)的半数抑制浓度 ( EC50 )为 44mg/L ;又利用 2 -脱氧 - D-核糖法产生· OH,在原花青素浓度为 1 0 g/L时可清除该体系中 80 %的· OH。

正交试验优化胶原多肽螯合钙的制备工艺

以胶原多肽及氯化钙为原料制备胶原多肽螯合钙并确定其最佳制备工艺,结果表明:胶原多肽螯合钙最适的螯合条件为钙元素和胶原多肽的质量比为13:100、pH6.0、时间30min、温度30℃。在该最佳螯合条件下得到的胶原多肽螯合钙的螯合率达到77.7mg/g。傅里叶变换红外光谱分析结果表明胶原多肽螯合钙是一种新的物质,后期的动物实验也证明了胶原多肽螯合钙具有增加骨密度的功能。

水翁花对微粒体和神经细胞氧化损伤的保护作用

目的 :研究水翁花对小鼠肝微粒体膜脂氧化及H2 O2 诱导的PC12神经细胞氧化损伤的保护作用。方法 :用小鼠肝微粒体膜脂氧化模型、细胞培养MTT法测定细胞的存活率等方法。结果 :水翁花水提物能强烈抑制小鼠肝微粒体膜脂氧化 ,IC50 为 0 .0 13g·L-1,效果优于阳性对照维他命E(IC50 为 0 .0 6 4 g·L-1) ;对H2 O2 引起的PC12神经细胞氧化损伤亦显示出较强的抑制作用 ,对神经细胞表现出保护作用。结论 :水翁花对膜脂氧化及神经细胞的氧化损伤的保护作用 ,可能用于治疗与氧化损伤有关的脑疾。

谷胱甘肽的简便测定法

目的： 建立一种快速简便测定谷胱甘肽的新方法。方法： 样品１ 式２ 份， ｐＨ８－０ 条件下分别和甲醛反应２ｍｉｎ 和６０ ｍｉｎ， 各取１ ｍＬ加入５ ｍＬＤＴＮＢ溶液， ２５ ℃反应５ ｍｉｎ 后分别测定在波长４１２ ｎｍ 的吸光度， 算出２者的差值ΔＡ， 代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量。结果： 谷胱甘肽浓度在０－１９ ～０－９５ ｇ·Ｌ－１ 之间线性关系良好， 回归方程为： Ｙ＝ ０－７１５ ４ Ｘ－ ０－０００ ４， ｒ＝ ０－９９９ ９ ， 最大误差不超过６ ％ 。结论： 方法成本低廉， 简单易行， 特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析。