桑树Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达

【目的】研究川桑液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)基因的功能,探究桑树耐盐机制,为植物抗逆基因工程筛选提供优良的候选基因。【方法】以川桑基因组数据库为基础,基于同源基因序列的保守性,以川桑叶片cDNA为模板克隆川桑液泡膜型NHX基因;利用生物学软件和在线公共平台,分析所得基因编码的蛋白质序列及功能结构域,并构建系统进化树,分析与其他物种的亲缘关系。采用荧光定量PCR方法研究在NaCl胁迫条件下不同时间段‘湖桑32号’根、茎、叶等不同组织中桑树NHX1表达量的变化情况;通过构建超量表达载体,将其转化到拟南芥中,分析转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中的种子发芽数,根长、侧根生长情况和幼苗成活率,并对转基因拟南芥连续浇灌含高浓度Na Cl的营养液,研究过量表达NHX基因对拟南芥的影响。【结果】本研究得到1个液泡膜型NHX基因,命名为MnNHX1(Gen Bank登录号:KJ720637);该基因ORF长度为1 644bp,编码547个氨基酸残基,具有Na+/H+交换泵,且在其上游含有抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点(LFFIYLLPPI)以及糖基化位点等结构域,TMHMM在线程序预测Mn NHX1具有12个明显的跨膜结构区;系统进化树分析结果显示,Mn NHX1具有较高的保守性,先与源于蔷薇科的桃聚合,与桑树形态学和基因组进化分析分类结果一致。荧光定量PCR试验表明,在无Na Cl胁迫条件下桑树NHX1在‘湖桑32号’根、茎、叶中均有表达;在Na Cl胁迫处理12 h后,根、茎中桑树NHX1的表达量显著增加,而后回落;而在胁迫处理24 h后,叶中桑树NHX1的表达量显著提高,随后回落。过量表达Mn NHX1的转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中,种子发芽率低于野生型,而根长和侧根生长情况以及幼苗成活率都优于野生型;连续浇灌含高浓度Na Cl营养液的转基因拟南芥生长状态更为优良。【结论】MnNHX1为优良的植物耐盐基因,在桑树中为组成型表达,并受Na Cl胁迫诱导,表现出组织特异性。过量表达Mn NHX1的拟南芥耐盐能力显著提高,生存在盐胁迫环境中,依然具有良好的生长和发育能力。

13份桑树杂交组合F_1代的耐盐性和耐旱性鉴定

为了筛选耐盐、耐旱性强的桑树杂交组合用于生态桑种植,选择来自新疆和田沙漠化地区的桑树品种资源策沙系列不同株系定向杂交组合F1代以及大面积推广应用的桂桑优系列杂交桑——桂桑优12、桂桑优62的桑种子和桑苗为试验材料,分别利用12 g/L NaCl和400 g/L PEG6000模拟盐分与干旱胁迫环境,测定桑种子在盐分胁迫下的相对发芽率、发芽势、发芽指数、盐害指数和基于五级评分法计算种子萌发期的耐盐性总分,并调查萌发幼苗在干旱胁迫下的成活率,鉴定供试桑树杂交组合F1代的耐盐和耐旱性能。从13个供试桑树杂交组合F1代中鉴定出耐盐性和耐旱性具有显著差异的4种类型,其中:极耐盐而对干旱敏感类型有桂桑优62,极耐盐、耐旱类型有策沙-杂6,高耐盐、耐旱类型有策沙-杂4、策沙-杂5和桂桑优12,极耐旱而对盐敏感类型有策沙-杂12。筛选出的上述桑树杂交组合中,桂桑优62适宜用于滨海滩涂盐碱地的植被恢复,桂桑优12和策沙-杂6适合用于常年干旱及盐碱化严重地区的植被恢复。

转桑树MAPK5基因拟南芥在不同逆境胁迫下的抗性分析

【目的】植物促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在响应生物与非生物胁迫中发挥重要作用。本研究通过分析桑树(川桑)B家族MAPK基因MnMAPK5的亚细胞定位和启动子活性,并将其转入拟南芥中进行过表达研究,探讨MnMAPK5在逆境胁迫下的作用机制。【方法】将MnMAPK5的上游启动子连接到p BI121载体上,通过花粉介导法转入拟南芥中,经高温、低温、NaCl和PEG处理后进行GUS染色分析。通过构建过表达载体,将MnMAPK5转化到拟南芥中,用T3转基因植株进行抗逆境胁迫分析。【结果】MnMAPK5基因的编码蛋白定位于细胞质和细胞核中。在拟南芥中检测MnMAPK5启动子驱动的GUS活性的结果显示,MnMAPK5启动子活性受到了高温、低温、高盐和干旱胁迫的诱导。在高盐、干旱、低温和H_2O_2处理条件下,过表达MnMAPK5抑制了转基因拟南芥的萌发和生长。在盐胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因植株中的MDA含量和POD活性,降低了CAT活性、可溶性糖含量和H_2O_2含量;在干旱胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥中的MDA和H_2O_2含量,降低了CAT和POD活性;在低温下,转基因拟南芥相比野生型植株表现出更低的CAT活性、POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量;在氧化环境胁迫下,转基因拟南芥的MDA含量显著高于野生型拟南芥,而脯氨酸含量和可溶性糖含量要低。此外,在各个胁迫环境条件下,AtPOD、AtCAT和AtRD22等胁迫相关基因的表达量在转基因植株低于野生型拟南芥。【结论】MnMAPK5启动子在转基因拟南芥中的活性受到了不同非生物胁迫的诱导。过量表达MnMAPK5降低了拟南芥对非生物胁迫的抵抗能力,表明MnMAPK5在逆境胁迫下起着负调控作用。

盐胁迫下不同桑品种种子萌发特性研究

设置7个NaCl质量浓度梯度(0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%)对粤桑69851、沙2×伦109、河南实生桑、桂优62四个桑品种种子进行NaCl胁迫处理,测定不同品种在不同处理下的发芽率、发芽势、发芽指数、盐害指数及胚根、胚芽长等指标,以研究NaCl胁迫对不同桑品种种子萌发特性的影响。结果表明,NaCl胁迫对不同桑种种子的萌发有相似的作用模式。低浓度的NaCl溶液(小于0.4%)可促进沙×伦109、河南实生桑、桂优62种子的萌发,当NaCl溶液浓度高于0.4%时则变为抑制作用。综合各项指标分析表明桂优62的耐盐性最强,其次为沙×伦109,再次为粤桑69851,河南实生桑的耐盐性最差。