镉致HEK293细胞凋亡中氧化应激作用

目的探讨镉在诱导人胚胎肾细胞(HEK293)凋亡中氧化应激的作用。方法采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用流式细胞仪和激光共聚焦检测胞浆内的活性氧(ROS)水平,采用分光光度法检测细胞内丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量,蛋白印迹法检测Bcl-2蛋白、Caspase-3酶原表达量的变化。结果在一定浓度范围内随着镉浓度的升高,凋亡率升高。在60μmol/L氯化镉诱导细胞6h,凋亡率达到最高;细胞内ROS生成显著增多;MND含量明显增多(P<0.01),GSH含量大幅下降(P<0.01);Bcl-2表达量较镉处理3h时表达量有所下降;Cas-pase-3酶原蛋白表达下降。结论镉诱导HEK293细胞凋亡的机制与ROS上升及其导致的氧化损伤、Bcl-2蛋白表达下调和Caspase-3的激活有关。

镉对HEK 293细胞线粒体损伤作用

目的探讨线粒体在镉诱导人胚胎肾细胞(HEK293)凋亡中的作用。方法分离HEK293细胞的线粒体,采用分光光度法检测线粒体膜通透性转运孔(MPTP)的开放程度;电镜观察线粒体的形态改变;荧光分光光度法测定线粒体膜电位(MMP)和活性氧(ROS)含量的变化;ATP酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量的测定。结果随着CdCl2浓度的增加,MPTP开放程度增加,并且这种增加能被MPTP特异性的抑制剂环孢素A(CsA)所抑制。电镜观察发现线粒体染镉后肿胀变形;中、高浓度CdCl2处理组线粒体膜电位都显著下降(P<0.05),ROS含量也显著增加(P<0.05和P<0.01)。在高浓度组,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降,MDA含量随CdCl2处理浓度增高而增加,LDH、SOD、GSH-Px活性随CdCl2处理浓度增高而下降,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论CdCl2破坏线粒体结构,引起MPTP的开放,MMP的降低,ROS含量增加,引起多种与凋亡相关的应激性损伤的发生。

抗HepG2核糖体展示抗体库的构建

[目的]构建鼠源抗HepG2核糖体展示抗体库。[方法]以培养的HepG2肝癌细胞4次免疫Balb/c小鼠,取脾脏分离总RNA,逆转录合成第一条链,PCR扩增重链可变区和轻链k,经linker DNA连接形成VH/k核糖体展示抗体库。将VH/k与pMD18-T载体的连接产物转化E.coli TG1,蓝白斑筛选,挑取白色菌落,提取质粒,PCR鉴定,并测序。[结果]VH和k链得到正确的扩增,长度分别为399和647bp,VH/k连接产物正确,连接产物长度为1 093 bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗HepG2核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗HepG2特异性单链抗体奠定基础。

镉对人肝细胞WRL-68离体线粒体结构及功能的影响

目的 研究氯化镉（CdCl2）对离体肝细胞线粒体结构及功能的影响。方法从培养肝细胞（WRL-68）中提取线粒体，各组分别用0、1、5、10μmol／LCdCl2进行处理。采用分光光度法检测线粒体膜通透性转运孔（MPTP）的开放程度；电镜下观察线粒体的形态改变；罗丹明123检测线粒体膜电位（MMP）的变化；测定线粒体内ATP酶LDH、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及丙二醛（MDA）的含量。结果随着CdCl2浓度的增加MPTP开放程度增加，并且MPTP的开放可被环孢霉素A（CsA）所抑制；电镜观察发现，线粒体经CdCl2处理后出现不同程度的肿胀变形；CdCl2诱导MMP显著降低；同时引起SOD、GSH-Px、Na^＋．K^＋-ATP酶、Ca^＋-Mg^＋-ATP酶LDH活性趋于下降，5、10μmol／L CdCl2显著下调了各种酶的活性（P〈0．05）；CdCl2处理组MDA含量升高，10μmol／LCdCl2处理组与对照组比较有统计学意义（P〈0．05）。结论CdCl2能引起离体肝细胞线粒体结构的破坏，并致MPTP开放、MMP下降、线粒体酶活性的改变等与细胞凋亡相关过程的发生。