嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ角蛋白酶的纯化及酶解研究

对突变的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ产生的角蛋白粗酶液的酶解范围进行研究,发现该酶对实验选用的角蛋白底物均有不同程度的酶解作用,酶解范围广泛;对不同颜色鸡毛的酶解研究表明,鸡毛颜色对完整鸡毛的角蛋白酶解影响较大,但当鸡毛经过粉碎等处理之后,颜色对其角蛋白酶解的影响不大;对角蛋白粗酶进行纯化,首先用硫酸铵粗提,然后经过葡聚糖凝胶Sephadex G-100和陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析,最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,得到该酶分子量为35.2ku。

基于微量DNA样本的简化甲基化文库构建方法研究

RRBS(简化甲基化测序)是一种有效研究DNA甲基化状态的测序方案。文库构建是该方案中最关键的实验步骤之一,RRBS文库构建往往因为酶切产物少,文库构建步骤繁多等因素,导致DNA起始量需要1 ug以上。然而很多来源于人的样本,如冰冻组织穿刺、石蜡切片、显微微切割等,都往往只能获得100 ng以下的DNA,无法满足常规RRBS文库构建的起始DNA总量要求,从而大大限制RRBS技术的应用范围。本研究主要探讨并设计了基于微量DNA样本(<100 ng)的RRBS文库构建策略,主要通过优化Msp I酶切条件、DNA片段大小筛选、缩减反应步骤及减少DNA转移次数等技术手段,大大提高了DNA回收率,进而建立了2种有效使用微量DNA样品的RRBS文库构建方案(即EA-Method和WB-Method方案)。EA-Method方案在处理100 ng左右的DNA时,有经济、快速、高效的特点,但文库质量略差于WB-Method方案;WB-Method方案可将DNA起始量降低至10 ng,并且文库质量高。为验证WB-Method方法的可靠性,研究人员选取了3种志愿者样本(全血和口拭子),采用WB-Method同时进行常量和微量RRBS文库构建,并进行Illumina Hiseq平台测序,数据通过生物信息分析得到微量RRBS检测的CpG,CHG,CHH中C碱基的甲基化比例与常量RRBS结果一致。同时,该方法可以大大降低DNA损耗及损伤,因而该方法可将RRBS技术应用到更广泛的样本类型中去,有效拓展RRBS的研究领域。