基于理性设计的β-甘露聚糖酶底物亲和力的定向改造

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A与甘露二糖对接复合物的空间结构;在此结构上使用PyMol软件统计到距甘露二糖8以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与AuMan5A一级结构序列全同率大于50%的β-甘露聚糖酶进行多序列比对;排除21个保守氨基酸位点,依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置,选择AuMan5A中的Tyr111、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸,将它们分别替换为性质相似的或在其他β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸,形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBSA法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能(ΔGbind),其中AuMan5AY111F的ΔGbind为-237.7kJ/mol,较其他酶的ΔGbind均低.基于该理性设计采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Tyr111的密码子TAC突变为编码Phe111的TTC,构建出突变酶基因(Auman5AY111F).分别将Auman5AY111F和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,并对重组表达产物reAuMan5AY111F和reAuMan5A进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明:reAuMan5AY111F对瓜尔豆胶的Km值由突变前的3.9mg/mL降低为2.5mg/mL;而突变前后酶的Vmax值变化不大.该研究运用多种生物信息学软件对提高AuMan5A底物亲和力进行了理性设计,并通过定点突变证实之,这为β-甘露聚糖酶乃至其他各种酶底物亲和力的定向改造提供了新的技术策略.

耐热β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达及酶学性质

基于生物信息学和基因组学分析的结果,采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉（AspergiLLus usamii）E001中克隆出一种糖苷水解酶（GH） 26家族β-甘露聚糖酶（AuMan26A）成熟肽编码基因（A uman26A）,成功实现其在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的异源表达.重组β-甘露聚糖酶（reAuMan26A）的发酵上清液对角豆胶的酶活性为281.9 U/mL,纯化后比酶活为2281.7 U/mg.其最造反应温度Topt为40℃;在80℃处理60 min后残留酶活性为60％;90℃时的半衰期T1/290为10 min,处理60 min后残留酶活性仍为33％;其最适pH为5.5,在pH 5.0～7.0的范围内较稳定;Fe^2＋和Fe^3＋对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;所测酶的最适底物为角豆胶,其次是魔芋粉和瓜尔豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/mL和7 841.9 U/mg.reAuMan26A良好的热稳定性使其在食品、饲料和纺织等工业具有广阔的应用前景.

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。

β-甘露聚糖酶末端残基变体对其酶学特性的影响

本研究用宇佐美曲霉Aspergillus usamii的5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A为母本,借助同源建模、分子对接及分子动力学模拟等理性设计方法,将AuMan5A的N-末端和C-末端分别截去3个无规则的氨基酸残基,构建出截短的β-甘露聚糖酶AuMan5AN3C3.将AuMan5A和AuMan5AN3C3的编码基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达,对表达产物进行了初步纯化并分析比较了其酶学特性及各自的表达水平.结果表明,reAuMan5A和reAuMan5AN3C3的最适温度Topt均为70℃,reAuMan5AN3C3在60℃的半衰期t1/260为38 min,较reAuMan5A(t1/260=40 min)略有降低;在相同表达条件下,reAuMan5AN3C3上清液的β-甘露聚糖酶活性为73.4 U/mL,较reAuMan5A的52.8 U/mL提高了39.0%;纯化的reAuMan5AN3C3酶比活性为182.7 U/mg protein,较reAuMan5A的126.3 U/mg protein提高了44.7%.与reAuMan5A相比,reAuMan5AN3C3对角豆胶的Km值下降不明显,Vmax值有显著提高.

β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达

为实现β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达,作者将经SalⅠ线性化的pPIC9K-xynⅡ电转化至工程菌GS115/Anman5A中,经G418浓度梯度筛选后获得能同时高产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的双重重组子GS115/Anman5A-xynⅡ。SDS-PAGE显示目的蛋白的相对分子质量分别约为52 000,24 100。摇瓶发酵筛选出产酶活性最强的转化株,命名为GSMX2,随后对该菌株的表达条件进行初步优化,优化后的表达条件为:诱导时间120 h,培养基起始pH值为7.0,甘油添加量为1.5%,甲醇添加量为1.5%。在此培养条件下,产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活性分别达到37.1 U/mL和193.6 U/mL。