水蛭分子鉴定方法的研究进展

水蛭基原复杂、市场混乱、传统方法难以有效鉴别,临床用药的安全性无法保障。分子鉴定方法根据生物间的分子特征差异进行鉴定,不受自然环境、生长发育阶段等外部因素影响,具有快速、准确、客观的特点。目前应用于水蛭的分子鉴定方法有:基于核酸的RAPD技术、SSR技术、DNA条形码技术和基于蛋白质的SDS-PAGE技术、同工酶分析技术,本文在简述水蛭不同分子鉴定方法研究进展的基础上,对水蛭不同分子鉴定方法的技术和应用特点进行比较,最后对DNA宏条形码技术、Target-sequencing技术、电化学传感检测技术在水蛭混合物,特别是中成药中水蛭成分的鉴定进行展望,旨在为水蛭鉴定方法的深入研究提供参考和借鉴。

基于ITS2序列的中药材苍术种苗DNA条形码鉴定

目的：建立基于DNA条形码技术的中药材苍术种苗鉴定方法。方法：收集中药材苍术及其易混品原植物样品28份，构建苍术种苗鉴定参考核糖体内部转录间隔区2（ITS2）条形码数据库。从河北、山东、山西、内蒙古、辽宁及湖北等苍术主产地收集苍术种苗52份。通过提取基因组DNA，聚合酶链式反应（PCR）扩增，双向测序获得其ITS2条形码序列。应用PUAP4．0软件计算种内、种间遗传距离，利用MEGA7．0软件构建邻接树，对中药材苍术种苗进行DNA条形码鉴定。结果：中药材苍术及其易混品原植物ITS2条形码序列具有稳定的序列差异，邻接树呈现单系性，可以明显区分苍术及其易混品；基于标准参考数据库，42份苍术种苗为朝鲜苍术（80．8％），7份苍术种苗为苍术（13．5％），3份苍术种苗为白术（5．7％）。结论：基于ITS2序列可以准确区分中药材苍术及其混伪品种苗。苍术种苗基原物种鉴定结果以朝鲜苍术为主，提示苍术临床用药存在潜在安全风险。

黄芩ITS2条形码数据库构建及其种子的DNA条形码鉴定方法建立

目的：通过构建黄芩核糖体DNA内转录间隔区2（ITS2）条形码数据库,建立黄芩种子DNA条形码鉴定新方法,保障黄芩种子基原准确。方法：收集黄芩对照药材、基原植物、生药材、公共数据库及其常见代用品的ITS2序列,构建黄芩DNA条形码数据库;收集62份市售黄芩种子样品,每份种子获取3-4条ITS2序列,基于BLAST方法、遗传距离法和邻接（NJ）系统发育树法进行物种鉴定。结果：共获得101条黄芩及其代用品的ITS2序列。黄芩的种内序列变异小于种间序列变异,黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,可相互区分。共获得195条黄芩种子的ITS2序列,DNA条形码鉴定结果表明193条为黄芩序列,2条为真菌序列。结论：黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠,可满足黄芩种子DNA条形码鉴定的需求。DNA条形码技术可用于黄芩种子的物种鉴定。

基于DNA metabarcoding技术的如意金黄散处方成分鉴定研究

中药的有效性和安全性是国内外关注的热点,本研究以如意金黄散为例,基于DNA metabarcoding技术,尝试从投料药材真伪角度评价中药的有效性和安全性.首先,收集如意金黄散处方成分药材及其混伪品样品161份,从已发表文献中下载密切相关物种序列154条,构建"如意金黄散DNA条形码鉴定数据库",该数据库包含10属119个物种.收集不同批次的如意金黄散样品3份,以ITS2序列为条形码,使用Illumina HiSeq平台进行PE250深度测序,利用本研究构建的"如意金黄散DNA条形码鉴定数据库"进行投料药材基原物种识别,结果表明,基于DNA metabarcoding技术可检测到除厚朴外的全部处方成分,不同药材的测序量存在显著差异;检测到苍术药材的混伪品朝鲜苍术和天南星药材的混伪品虎掌南星,提示如意金黄散临床使用的有效性和安全性存在潜在风险;不同批次鉴定结果具有稳定性和可重复性.本研究表明,基于DNA metabarcoding技术的如意金黄散处方成分鉴定方法符合中药复杂体系特点,有望成为中成药鉴定的新方法,并为中成药的有效性和安全性评价提供参考.

三七片DNA条形码分子鉴定及方法学考察

目的为研究DNA条形码技术在中成药鉴定中的应用,以三七片为研究对象,对方法的适用性、专属性与精密度进行考察。方法收集15批次市售三七片样品,考察三七片DNA提取条件,并对“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”中PCR扩增、序列获得、结果判定等方法适用性进行确认;收集三七、人参、西洋参,制作三七片及其掺伪品,考察方法的专属性和重现性。结果三七片取样量100 mg,56℃水浴8 h所获得DNA的质量浓度平均值为60.7 ng/μL,PCR扩增、序列获得和结果判定均可获成功;三七、人参和西洋参的ITS2序列长度均为230 bp,三七与人参、三七与西洋参的序列间均存在7个稳定的SNP位点,自制三七片和掺伪三七片均可成功获得ITS2序列,不同比例三七与人参、三七与西洋参的测序峰图在SNP位点处呈现相应峰高比的SNP套峰具备专属性;重复性、中间精密度和重现性考察符合《中国药典》2015年版(通则9101)相关要求。结论ITS2序列作为DNA条形码能够稳定、准确鉴定三七片的原料药材,具备良好的专属性和精密度,三七片DNA条形码分子鉴定法将为保障三七片临床用药安全提供新的技术手段,并对《中国药典》其他收载单方制剂的鉴定提供参考。

普乐安片DNA条形码分子鉴定研究

建立基于DNA条形码技术的普乐安片处方成分鉴定方法。共收集8个厂家的16份普乐安片样品,分别采用植物和动物基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA,所获DNA的ITS2序列扩增成功率均为100%,细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列扩增成功率分别为43.75%和56.25%。对于ITS2序列,12份样品可获得高质量测序峰图,鉴定结果为油菜Brassica campestris,4份样品存在较严重套峰,经克隆测序鉴定为油菜和黑芥B.nigra。对于COI序列通用引物获得的9份PCR产物,其中2份样品可直接进行PCR产物测序,鉴定结果为蚜虫类,7份样品经克隆测序获得82条序列,其中5份样品可检测到意大利蜜蜂Apis mellifera,7份样品均可检测到病原菌或病虫害。为解决COI通用引物因外源污染导致的蜜蜂源检测失败问题,新设计2对蜜蜂属Apis的COI引物,扩增效率均为43.75%,7份PCR产物直接测序的鉴定结果均为意大利蜜蜂A.mellifera。9份未检测到蜜蜂源的普乐安片来自同一厂家生产的3个不同批次,且每个批次含3份样品,推测原料花粉非蜜蜂采集所得。本研究基于ITS2和COI序列建立了普乐安片处方成分的鉴定方法,将为普乐安片的质量控制和市场监管提供科学依据和技术保障。

基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定

目的:建立基于核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列的北柴胡种子分子鉴定方法,保障北柴胡栽培种子的物种准确。方法:收集北柴胡及主要栽培柴胡属物种种子、市售北柴胡种子样品共59份,探究不同取样量和不同水浴条件对种子DNA提取质量的影响,建立柴胡属种子DNA提取方法;通过聚合酶链式反应(PCR)和双向测序得ITS条形码序列。从GenBank下载34条北柴胡、红柴胡、黑柴胡等主要栽培柴胡属物种ITS序列,丰富北柴胡种子鉴定数据库;利用MEGA-X10.0.5进行变异位点分析并构建邻接(NJ)系统发育树,考察ITS序列对北柴胡种子的物种鉴定能力;基于BLAST方法和NJ系统发育树法对市售北柴胡种子进行DNA条形码鉴定。结果:共获得59条北柴胡、红柴胡、三岛柴胡及市售北柴胡种子的ITS序列,北柴胡ITS序列可分为6个单倍型,包含7个变异位点,NJ系统发育树表明北柴胡所有单倍型可形成独立的枝,与所收集样品中其他柴胡属栽培物种可相互区分,具备北柴胡种子物种鉴定能力。基于ITS条形码序列鉴定发现19份市售北柴胡种子中有3份为三岛柴胡,伪品率15.8%。结论:基于ITS序列的DNA条形码技术可以准确可靠地鉴定北柴胡种子及其易混品,可为我国中药材种子规范化建设提供参考。

基于ITS2序列的市售木通药材及其混伪品的分子鉴定12

目的建立基于核糖体内部转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列的木通药材DNA条形码鉴定方法,对市售木通药材进行物种分析。方法收集河北、安徽、贵州等地的样品总计45份,其中木通药材及其混伪品的原植物样品18份,市售木通药材样品27份。通过提取DNA、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增、双向测序获得ITS2序列,基于邻接(neighbor joining,NJ)系统发育树和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点进行物种鉴定分析。结果基于木通药材及其混伪品原植物ITS2序列构建的NJ树分析结果表明,木通药材正品及其混伪品在NJ树上聚为独立的分支,木通药材正品及其混伪品在NJ树上可明确区分;基于NJ树对27份市售木通药材的物种分析表明,市售样品中仅有4份为正品木通,2份为小木通,21份为粗齿铁线莲,正品率为14.8%。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术可以准确区分中药材木通及其混伪品,市售木通药材物种较混乱。