静脉移植缺氧预处理骨髓间充质干细胞在大鼠早期激素性股骨头坏死中的作用

目的探讨缺氧预处理对骨髓间充干细胞(BMSCs)的细胞基本功能的影响及静脉移植缺氧预处理BMSCs在大鼠早期激素性股骨头坏死(SONFH)中的防治作用。方法提取大鼠BMSCs分离培养,流式细胞仪鉴定表面抗原(CD34、CD44、CD45和CD90),通过细胞计数试剂盒(CCK-8)分析、划痕实验、茜素红及碱性磷酸酶染色对常氧组(No)和缺氧组(Hp)BMSCs细胞功能进行评估。32只SD大鼠随机分为4组,对照组(C组)、模型组(M组)、常氧组(N组)和缺氧预处理组(H组),M组使用脂多糖[2 mg/(kg·d)]联合甲基强的松龙[20 mg/(kg·d)]构建SONFH模型,N组和H组构建模型的同时分别通过尾静脉注射107单位的常氧培养和缺氧预处理大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs),6周后取股骨头固定后进行Micro CT扫描及重建。股骨头脱钙切片后用苏木精-伊红(HE)染色观察并统计骨坏死发生率。两组间均数比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(组间两两比较采用LSD-t检验)。结果rBMSCs流式鉴定结果显示:rBMSCs高表达CD44(100%)和CD90(99.4%),低表达CD34(0.48%)和CD45(0.39%);CCK-8显示缺氧预处理能够增强BMSCs的增殖能力(t=7.199,P<0.05);划痕实验表明Hp组在12 h(t=2.462,P<0.05)、24 h(t=2.471,P<0.05)和36 h(t=3.434,P<0.01)均表现出增强的迁移能力;茜素红染色显示缺氧处理对rBMSCs的体外矿化能力有显著的增强作用(t=6.722,P<0.05)。碱性磷酸酶(ALP)染色表明缺氧预处理能够显著增强rBMSCs的体外成骨能力(t=13.37,P<0.05)。动物实验中C、M、N和H组的骨坏死发生率分别为0%(0/16)、87.5%(14/16)、25.0%(4/16)和12.5%(2/16),移植缺氧预处理rBMSCs能够明显减少SONFH的发生率;HE染色C、M、N和H组的空骨陷窝率分别为(2.765±0.423)%、(30.817±1.203)%、(14.724±1.312)%和(8.487±1.671)%,表明rBMSCs治疗组空骨陷窝的发生率明显下降(F=286.3,P<0.05);Micro CT扫描测量结果表明rBMSCs治疗后大鼠股骨头BV/TV、Tb.Th、Tb.N均明显增加(F=197.6、290.7、68.7,P<0.05),而Tb.Sp明显减少(F=123.8,P<0.05)。证明静脉移植rBMSCs能够改善股骨头的微观结构,并且缺氧预处理后的rBMSCs改善作用更加显著(P<0.01)。结论缺氧预处理能够明显改善rBMSCs的增殖、迁移和体外成骨能力,有利于增强rBMSCs对大鼠SONFH的防治作用。

β-榄香酮酸对白细胞介素-1β作用下大鼠软骨细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的:观察β-榄香酮酸(β-EA)对白细胞介素-1β(IL-1β)作用下大鼠软骨细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法:提取大鼠原代软骨细胞并使用甲苯胺蓝鉴定,将其用随机数字表进行简单随机分组,分为对照组、IL-1β组、β-EA低、高剂量组。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测软骨细胞活力,采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测各组软骨细胞增殖水平,Transwell法检测细胞迁移,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法(Western blot)检测大鼠软骨细胞凋亡相关蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)的表达水平。使用单因素方差分析进行数据处理。结果:对正常软骨细胞用不同浓度β-EA处理后,对照组、β-EA低剂量组、β-EA高剂量组的细胞活力分别为97.00%、97.36%、95.80%;按分组处理的对照组、IL-1β组、β-EA低剂量组、β-EA高剂量组软骨细胞活力分别为97.22%、49.57%、60.20%、79.95%;正在增殖的细胞百分比分别为28.38%、9.16%、13.62%、24.56%;细胞迁移数分别为354.67、86.67、136.67、192.67个;细胞凋亡率分别为12.18%、36.74%、24.41%、16.98%。这些结果表明β-EA对正常软骨细胞无明显毒性(F=0.438,P>0.05),并对IL-1β作用下的受到抑制的软骨细胞活力具有促进恢复作用(F=379.200,P<0.05)。IL-1β组中增殖、迁移的细胞明显低于对照组(F=84.920、117.100,P<0.05);β-EA低、高剂量组增殖、迁移的细胞数明显高于IL-1β组(F=84.920、117.100,P<0.05)。IL-1β明显诱导大鼠软骨细胞凋亡(F=169.600,P<0.05);通过高、低剂量的β-EA处理后,IL-1β作用下的大鼠软骨细胞凋亡明显受到抑制(F=169.600,P<0.05)。同时凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9、bax的蛋白水平表达明显降低(F=111.600、50.830、132.500,P<0.05),bcl-2明显升高(F=59.850,P<0.05)。结论:β-榄香酮酸可促进IL-1β作用下大鼠软骨细胞增殖和迁移并抑制其凋亡,对软骨细胞具有保护作用。

两面神激酶2/信号传导及转录激活因子3信号通路在地塞米松诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡中的作用

目的探讨两面神激酶2/信号传导及转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路在地塞米松(DEX)诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡中作用机制。方法将成骨细胞MC3T3-E1分为3组,分别为对照组、DEX组、DEX+AG490组。对照组只加入正常培养基,DEX组加入200μmol/L的DEX培养,DEX+AG490组预先给予50μmol/L的AG490处理后加入200μmol/L的DEX培养。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测通路蛋白及凋亡蛋白的表达。组间比较采用t检验。结果对照组、DEX组、DEX+12.5、25、50、75μmol/L的AG490的细胞存活率分别为(97.74±1.45)%、(52.05±5.50)%、(54.98±3.77)%、(70.99±4.15)%、(81.53±6.43)%、(79.16±7.35)%。表明DEX明显使成骨细胞MC3T3-E1活力降低(t=11.364,P<0.001),50μmol/L JAK2/STAT3通路抑制剂(AG490)明显抑制了DEX对成骨细胞MC3T3-E1活力的降低作用(t=4.928,P<0.01)。对照组、DEX组、DEX+AG490组的细胞凋亡率分别为(6.067±0.545)%、(26.233±2.631)%和(8.463±1.179)%。表明DEX明显诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡(t=12.999,P<0.001),经AG490处理后,DEX诱导的成骨细胞MC3T3-E1凋亡明显受到抑制(t=10.675,P<0.001)。蛋白质印迹法(Western blot)检测正常组、DEX组、DEX+AG490组p-JAK2蛋白表达分别为1.000±0.323、2.839±0.640、0.286±0.068,p-STAT3蛋白表达分别为1.000±0.245、3.471±0.157、0.618±0.078,bax蛋白表达分别为1.000±0.083、6.571±0.405、3.048±0.905,bcl-2蛋白表达分别为1.000±0.086、0.207±0.040、0.563±0.083,cleaved Caspase-3蛋白表达分别为1.000±0.192、5.685±0.699、3.411±0.247。DEX组较对照组p-JAK2、p-STAT3、cleaved Caspase-3、bax的表达明显增加,bcl-2的表达明显减少(t=4.429、14.912、11.100、23.561、14.565,P<0.05),AG490+DEX组较DEX组p-JAK2、p-STAT3、cleaved Caspase-3、bax的表达明显减少,bcl-2的表达明显增加(t=6.860、28.404、5.262、6.185、6.721,P<0.01)。结论DEX通过JAK2/STAT3信号通路,调节cleaved Caspase-3、bax、bcl-2的表达,诱导成骨细胞MC3T3-E1凋亡。