基于假病毒的人乳头瘤病毒小鼠感染模型的建立及HPV16VLP疫苗保护性评价

目的建立基于假病毒的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)小鼠感染模型并应用于HPV16 VLP疫苗的保护性评价。方法利用293FT细胞制备携带Luc报告基因的HPV16假病毒,纯化后检测HPV16假病毒滴度和性质;利用醋酸甲羟孕酮和β-雌二醇处理雌性BAL B/c小鼠,然后用壬苯醇醚-9(N-9)化学损伤BALB/c小鼠阴道,6 h后用HPV16假病毒感染小鼠阴道,48 h后使用活体检测仪检测小鼠阴道中Luc报告基因的表达情况;最后,利用该感染模型评价HPV16 VLP疫苗的保护能力。结果获得了含有Luc报告基因的HPV16假病毒,建立了HPV假病毒纯化方法;Western blot结果显示HPV16假病毒中含有L1和L2蛋白;建立了HPV假病毒感染小鼠模型,并通过不同剂量的假病毒感染实验表明,该感染模型所需的最低假病毒剂量是1.7×104TRLU;利用该模型获知HPV16 VLP疫苗具有较强的抵抗HPV16假病毒感染的能力,当中和抗体滴度为256时即可阻碍HPV假病毒感染。结论本研究成功地建立了HPV假病毒小鼠感染模型,并运用该模型评价了HPV16 VLP疫苗的保护作用,为HPV中和抗体研究和候选疫苗的免疫保护评价提供了有效工具。

抗HPV11病毒样颗粒单克隆抗体的性质鉴定及初步应用

目的分析和鉴定抗HPV11病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)鼠源单克隆抗体的性质,筛选性质和生物学活性较优的抗体,并初步应用于抗原或疫苗的质量分析。方法分别利用间接ELISA法和Western blot对HPV11的22株单克隆抗体的亚类、与HPV11 VLP的结合能力和构象敏感性进行检测;采用血凝抑制实验对单克隆抗体的血凝抑制活性进行分析;运用基于假病毒的抗体中和实验对单克隆抗体的中和活性进行鉴定,选出中和活性高的单抗进行两两配对,采用双抗夹心ELISA法捕获单抗并筛选合适的配对双抗。结果对22株单抗的性质进行了详细和完整的鉴定,并根据构象敏感性进行排序,筛选出6株型别特异、结合活性强且中和活性高的单抗(2A2、4A1-3、16G7、14A6、9C12和19C7);成功建立了基于单抗的双抗夹心(14A6∶Ag∶9C12-HRP)ELISA定量分析方法。结论获得了较全面的HPV11 VLP单抗性质信息,建立了重组HPV11抗原质量分析的双抗夹心ELISA法,为HPV11抗原的生命周期管理或尖锐湿疣疫苗的研发、工艺优化、产品放行和稳定性研究等提供了技术支持。

人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究

利用PCR技术从HPV16阳性阴道分泌物标本中获得HPV16 L1基因片段,并将其插入表达载体pTO-T7中,构建重组表达质粒pTO-T7-HPV16-L1;以该重组质粒转化大肠杆菌ER2566并表达HPV16 L1蛋白;所表达的HPV16 L1蛋白经过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析等纯化步骤后,HPV16 L1纯度达到98%以上,并可在体外装配为直径50nm的病毒样颗粒;动物免疫原性研究结果显示,该病毒样颗粒可诱导高滴度的针对HPV16的中和抗体。上述研究结果表明通过大肠杆菌表达系统制备的HPV16病毒样颗粒具有纯度高,与天然病毒颗粒形态高度相似的特点,并具有高度免疫原性,可以应用于HPV16病毒样颗粒的结构功能研究及HPV16疫苗研发等领域。

高危型人乳头瘤病毒诱导的抗体水平与宫颈病变的相关性

目的研究高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染相关的宫颈病变程度与抗人乳头瘤状病毒(HPV)抗体水平的相关性,探讨HPV致病的免疫学问题。方法选取2012年1月-2013年6月在该院妇产科门诊就诊的女性中选取60例病理确诊为女性宫颈病变(CINⅠ及以上),且宫颈脱落细胞的DNA检测为HR-HPV阳性者为研究组,根据组织学检测结果将研究组进一步分为低度病变组30例(CINⅠ)和高度病变组30例(CINⅡ或Ⅲ)。对照组为经核酸检测无HPV感染且病理诊断未见癌前病变的门诊患者60例,按年龄进一步分为低年龄组和高年龄组。低年龄组和高年龄组与低度病变组和高度病变组的年龄差异无统计学意义(P>0.05)。分别抽取研究组及对照组外周血,检测其抗HR-HPV L1 Ig G抗体及中和抗体滴度,比较研究组与对照组抗体阳性率及抗体滴度水平的差别。结果研究组血清中的抗HR-HPV L1 Ig G抗体阳性率及抗体滴度均高于对照组(P<0.05);低度病变组患者血清中的抗HR-HPV的中和抗体滴度高于相应对照组(P<0.05),而高度病变组的抗HR-HPV的中和抗体阳性率及抗体水平与相应对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论宫颈病变患者血清中抗HR-HPV L1 Ig G抗体升高,说明HPV感染可引起机体的体液免疫反应。低度病变组的中和抗体水平相对较高,可能是机体产生的中和抗体阻止了病毒的进一步感染。高度病变组的Ig G抗体和中和抗体均低下,说明进入CINⅡ/Ⅲ后HPV已经逃避了免疫系统的监视。

大肠杆菌来源的人乳头瘤病毒11型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

【目的】利用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒11型病毒样颗粒(HPV11VLPs),并对其免疫原性和所诱导中和抗体的型交叉反应性进行研究。【方法】在大肠杆菌ER2566中非融合表达HPV11-L1蛋白,并通过离子交换层析,疏水相互作用层析其进行纯化。纯化后的HPV11-L1经体外组装形成病毒样颗粒,通过动态光散射,透射电镜检测其形态,并通过多种HPV型别假病毒中和实验评价HPV11VLPs的免疫原性及型交叉反应性。【结果】HPV11-L1蛋白在大肠杆菌中可以以可溶形式表达。经过硫酸铵沉淀、离子交换和疏水相互作用色谱纯化,目的蛋白纯度能够达到95%以上。纯化的HPV11-L1蛋白去除还原剂DTT后,能够在体外自发组装成为直径约50nm、与天然病毒颗粒形态高度相似的VLPs。动物实验结果显示,该病毒样颗粒在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量(ED50)为0.031μg,在小鼠体内可诱导高达106的中和抗体滴度,这些中和抗体与HPV6有较好的交叉反应,与HPV18有一定的交叉反应,而与HPV16没有明显的交叉反应,这一结果与分子进化树的分析相一致。【结论】本研究利用原核表达系统获得了具有较高免疫原性的HPV11VLPs,为HPV11预防性疫苗的研制奠定了良好的基础。

抗H5亚型禽流感病毒单链抗体在毕赤酵母中的分泌型表达和生物活性分析

在本实验室研制出的多株针对H5N1亚型禽流感血凝素单抗中,13D4单抗对所有H5亚型病毒均有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强和识别广的特点,且在小鼠实验中显示了对各种代表株禽流感的感染和发病均具有良好的治疗效果。在此研究基础上,本实验通过基因工程构建含有13D4单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达和纯化。经过竞争法和血凝抑制检测其活性,表明获得的单链抗体具有与原始鼠源抗体相近的反应活性和相同的识别表位。H5N1广谱中和单抗13D4的单链抗体的成功构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础。

三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统的建立及评价

目的建立三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统，并评价其在检测HPV九价疫苗免疫血清免疫原性的应用。方法分别选取红色、绿色和蓝色荧光蛋白的质粒N31-MCHREEY、N31-EGFP和N31-mTagBFP构建HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒，利用双抗夹心法和病毒半数组织培养感染剂量法检测HPV假病毒浓度和感染滴度；利用单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒，检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和滴度，以验证三色混合荧光HPV假病毒系统的准确性；采用单色荧光和三色混合荧光HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒系统检测HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清的中和滴度，判断其是否可应用于HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测。结果含有绿色、红色和蓝色荧光质粒的HPV16型假病毒的浓度为5~6 μg/ml，HPV6/11/18/31/33/45/52/58的三色混合荧光假病毒浓度为1~3 μg/ml。获得了分别含有EGFP、Mcherry和mTagBFP报告基因的9个型别的HPV假病毒，且满足中和检测需要；9个型别单色荧光HPV假病毒的滴度值均在1×104~1×105之间，即它们具有相似的感染滴度。检测HPV九价疫苗免疫的小鼠血清时，单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒系统所得中和滴度值差异均无统计学意义（P值均〉0.05）；检测HPV九价疫苗免疫的食蟹猴血清时，单色荧光与三色混合荧光A、B和C组HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒所得中和滴度值差异均无统计学意义（P值均〉0.05）。结论成功地建立了三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统；验证其与单色荧光HPV假病毒系统具有一致性；证实其可应用于检测HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测中。