一种检测血清心肌肌钙蛋白I的生物传感器

目的 :建立一种新的血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)定量检测法。方法 :用亲和层析法提纯cTnI,免疫BALB C鼠及新西兰兔 ,并用杂交瘤技术及膜渗滤亲和层析法 ,制备了特异性抗cTnI单克隆抗体和多克隆抗体。以葡萄球菌蛋白A作基底膜 ,特异性多克隆抗体作捕捉抗体 ,单抗 9F5作第二抗体 ,制成了表面等离子体共振生物传感器。比较了直接法和夹心免疫法检测血清cTnI的性能。结果 :夹心免疫法的最低检测限 (0 8μg L)是直接法的 5倍 (4 μg L) ,检测范围为 (0 8～ 2 0 ) μg L ,批内及批间精密度分别达 3 8%～ 5 1% ,6 3%～ 8 1%。用该夹心法及国外试剂盒分别检测 4 0名健康献血队员和 2 8例急性心肌梗死患者血清cTnI水平 ,两者符合率分别为 97 5 %和 94 6 %。结论 :所建立的夹心免疫法操作简单 ,特异性强 ,灵敏度高 ,符合临床诊断要求。

人心肌肌钙蛋白Ⅰ的分离纯化

目的 制备抗人cTnⅠ单克隆抗体 ,以便进一步制备AMI诊断制剂。方法 用兔骨骼肌Tnc(sTnC)制备TnC Sepharose 4B亲和柱 ,直接从心肌组织中分离提纯人cTnⅠ。结果 所提纯的cTnⅠ经SDS PAGE分析已达电泳纯 ,其相对分子质量和氨基酸组成与文献报道相符。结论 为建立AMI早期诊断试剂奠定了基础。

用多克隆抗体构建的夹心免疫传感器检测心肌肌钙蛋白I

用表面等离子体子共振生物传感器构建对心肌肌钙蛋白 I特异性的免疫传感器检测心肌肌钙蛋白 I,并建立两种检测方法 :直接法的最低检测限为 2 .5 μg/L,基于传感膜上的夹心免疫法的灵敏度为 0 .5 μg/L,检测范围为 0 .5～ 2 0 μg/L,批内及批间精密度分别为 3 .5 %～ 4.9% ,6.1 %～ 7.4% ;用夹心法及国外试剂盒对 40名健康献血者和 2 0例急性心肌梗死患者血清心肌肌钙蛋白 I水平进行检测 ,两者符合率为 95 % .

特异性抗cTnI多克隆抗体的制备

目的 制备特异性抗人心肌肌钙蛋白1（cTnI）多克隆抗体。方法 用人cTnI免疫家兔,制备抗人cTnI多克隆抗体,采用膜渗滤亲和层析法吸附掉与骨骼肌肌钙蛋白1（aTnI）有交叉反应的多抗,制备特异性抗cTnI多克隆抗体。结果 抗体经槽式对流兔疫电泳、酶联免疫吸附试验证明对cTnI具有高度特异性,与sTnI无交叉反应。结论 为应用一步夹心酶联免疫吸附法检测cTnI奠定了基础。

心肌肌钙蛋白Ⅰ──心肌细胞损伤的特异性标志物

本文从生物学及免疫学方面综述心肌肌钙蛋白Ⅰ的特性，并讨论其分离提纯方法、单克隆抗体的制备、血清学检测法及临床意义。

家兔肌钙蛋白的分离纯化

目的 分离提纯肌钙蛋白Ｉ（ＴｎＩ）以便制备心肌梗塞诊断试剂。方法 采用离子交换、分子筛、疏水 层析相结合的方法分离纯化兔骨骼肌肌钙蛋白Ｃ（ｓＴｎＣ）．制备ＴｎＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱。结果 所提纯的ｓＴ－ ｎＣ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析已达到电泳纯，经ＵＶ－２５０扫描显示出特异性吸收曲线，证明其含有较多的苯丙氨酸，而不含 色氨酸，进一步证明其纯度。结论 为提纯ＴｎＩ创造了条件。

量子点偶联抗体型夹心免疫传感法检测心肌肌钙蛋白I

将纳米量子点（QD）的放大作用与夹心免疫传感技术相结合，首次应用量子点标记抗体和表面等离子体共振生物传感器（SPR）对心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）进行特异性定量检测．利用N-羟基琥珀酰（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）将量子点偶联到cTnⅠ的单克隆抗体2F11上，再利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）验证偶联是否成功，膜印迹法证明标记后的2F11具有良好的生物学和免疫学活性，最后以蛋白A为基底膜、特异性抗心肌肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体为第-抗体（捕捉抗体）、QD标记的抗心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体2F11为第二抗体（检测抗体），用表面等离子体共振生物传感器构建了对心肌肌钙蛋白Ⅰ具有特异性的夹心免疫传感法，并成功用于检测心肌肌钙蛋白Ⅰ．本法的检测范围为0．4～15μg/L，检出限为0．4μg/L，较未标记夹心法和直接法分别提高了约2倍和10倍．

人谷胱甘肽过氧化物酶的生物信息学分析

目的应用生物信息学技术,全面了解人谷胱甘肽过氧化物酶(Human Glutathione Peroxidase,h GPx)蛋白家族的理化性质、结构及功能.方法以NCBI中报道的h GPx家族8个成员为研究对象,利用Prot Param,Net NGlyc,Net OGlyc,Net Phos,SOPMA,Clustal W,Pymol,MEGA 5.05等多种生物信息学软件,分别对其分子量、等电点、亲水性、糖基化、磷酸化和结构等方面进行分析,并建立其分子系统进化树.结果通过比对发现:h GPx超家族8个成员的物理性质存在明显差异,而在结构及功能上存在相似特征.结论 h GPx是一类具有明确酶活性的硒蛋白,具有清除体内过量的ROS、保护机体免受氧化损伤的作用.

用表面等离子体子共振传感器测定人心肌肌钙蛋白I的研究

采用自组装表面等离子体子共振 (SPR)传感装置 ,固定入射角 ,以波长为变量 ,以 CCD为检测系统 ,用对金和抗体均有较强吸附作用的葡萄球菌 A蛋白作为基底膜 ,观测了人心肌肌钙蛋白 I的抗体和抗原之间免疫反应的动力学过程 ,并进行了人心肌肌钙蛋白 I的定量测定 .结果表明 ,人心肌肌钙蛋白 I的浓度在5 .0～ 5 0 μg/L范围内与传感器的响应值呈线性关系 .

具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒人源单链抗体的制备

以谷胱甘肽(GSH)为靶抗原,从噬菌体展示人源单链抗体库中筛选人源单链抗体(scFv).经3轮筛选后,用ELISA方法检测出5个(2,11,16,24,32)可以和GSH结合的克隆.PCR产物的电泳和测序结果表明,只有3个克隆(11,16,24)具有完整的scFv编码基因.选取和GSH结合力高的克隆11的scFv编码基因组装到表达载体pPELB上,在大肠杆菌Rosetta中进行可溶性表达,用Ni2+螯合亲和层析纯化scFv-11,免疫点印迹结果证实该抗体能与GSH特异结合.通过化学突变将scFv-11的丝氨酸转变成硒代半胱氨酸(Sec)后,获得了具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力的含硒(Se)人源单链抗体(Se-scFv-11),其活力为351U/μmol.

量子点标记的斑点免疫渗滤分析定量检测cTnI

利用量子点良好的光谱特征和光化学稳定性,结合免疫分析技术,对心肌肌钙蛋白I(cTnI)特异性进行定量检测.用量子点标记cTnI的单克隆抗体(2F11),通过SDS-PAGE电泳证明标记成功.斑点免疫膜渗滤法证明标记后的2F11仍具有良好的生物学活性,再将标记并纯化后的2F11与NC膜上不同浓度的cTnI进行免疫反应,使用Im ageM aster图像分析软件对膜上荧光斑点图像进行定量分析.应用此方法测得cTnI的浓度和斑点处相对荧光值有良好的线性关系(R2=0.9966),最低检出值为120 ng.

具有GPX活性单链抗体的制备及其抗氧化效应

为实现单链抗体的可溶性表达,制备具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力的单链抗体,在单链抗体表达载体pTMF 2F3上去除原2F3基因N端非必需的18个氨基酸,采用新的表达载体pRose质粒,在2F3的N端引入13个氨基酸的前导肽,转入BL21(lysS)中,使其分泌到大肠杆菌的周质腔中得以表达,获得可溶性表达产物.产物经过分离纯化、WesternBlot印迹和硒化测活确定具有GPX活性的鼠单链抗体,其GPX活力为2530U/μmol.以脂质过氧化、细胞存活率和细胞膜完整性为指标的抗氧化实验研究表明,具有GPX活性的单链抗体对大鼠乳鼠表皮细胞有抗紫外线损伤的作用,是膜脂质过氧化的有效抑制剂.

量子点与人源抗谷胱甘肽单链抗体的连接与表征

用已构建的表达载体pPELB-B3,在大肠杆菌Rosetta中可溶性表达人源抗谷胱甘肽(GSH)单链抗体B3(scFv-B3),经N i2+螯合亲和层析纯化后,用点印迹法验证了其与GSH结合的特异性.将水相合成的半导体纳米粒子(半导体量子点,QD s)在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下,与scFvs连接.光谱分析和膜印迹结果表明,scFvs成功地共价连接到QD s表面,所得的QD-scFvs复合物能够较好地识别GSH.荧光显微镜观察QD-scFvs与人乳腺癌细胞MCF-7的作用结果,初步判断QD-scFvs能够跨膜进入细胞.

单纯性肥胖儿童头发钙、血钙与红细胞钙的关系

目的：探讨儿童单纯性肥胖与钙的关系。方法：对65名12～14岁单纯性肥胖儿童的头发钙、血钙与红细胞钙用原子分光光度法进行检测，应用SPSS软件进行统计学分析。结果：与正常儿童比较，单纯性肥胖儿童发钙水平降低（P〈0．05），红细胞钙升高（P〈0．05），血浆钙差异无显著性（P〉0．05）。结论；钙缺乏是单纯性肥胖的原因之一，提示应对单纯性肥胖儿童增加日照和机体补钙。

槽式对流免疫电泳法检测可提取性核抗原抗体的研究

用引进的槽式对流免疫电泳法（槽ＣＩＥ）和国内常规的免疫双扩散法（ＩＤ），同时对８９例病人血清可提取性核抗原（ＥＮＡ）的抗体进行了测定和比较。槽ＣＩＥ法图像清晰、沉淀线呈弧型，结果明显比ＩＤ法容易判断，ＥＮＡ抗体阳性病人血清的检出率非常显著地高于ＩＤ法（Ｐ＜０．００１），抗ＳＭ、ＲＮＰ、ＳＳＡ、ＳＳＢ等每种抗休的检出率也均高于ＩＤ法，其中前３种差异非常显著（分别Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．００１）。

哮喘儿童血清白细胞介素4、转化生长因子β_1及IgE水平的变化及临床意义

目的:探讨哮喘儿童血清白细胞介素4(IL4)、转化生长因子β1(TGFβ1)及IgE水平变化及临床意义。方法:对98例哮喘患儿应用双抗体夹心ELISA法,检测血清IL4、TGFβ1、IgE水平,其中发作期42例、缓解期56例;设正常对照52例。结果:在哮喘组,血清IL4、IgE水平明显高于对照组[(12.09±6.00)ng·L-1,(58.16±15.47)ng·L-1](P<0.05),TGFβ1水平显著低于对照组[(181.59±96.05)ng·L-1](P<0.05);在发作期血清IL4、IgE水平[(105.86±34.33)ng·L-1,(270.21±74.84)ng·L-1]均高于缓解期[(61.58±11.04)ng·L-1,(152.80±45.15)ng·L-1](P<0.05),在发作期血清TGFβ1水平[(41.97±12.77)ng·L-1]均低于缓解期[(63.40±23.40)ng·L-1](P<0.05)。IL4与IgE呈正相关(r=0.581,P<0.001),TGFβ1分别与IL4、IgE呈负相关(r1=-0.614,P<0.001;r2=-0.609,P<0.001)。结论:IL4可促进哮喘患儿IgE分泌,并抑制嗜酸性粒细胞产生TGFβ1,这一机理在哮喘发病中起重要作用。

红细胞标记抗体的化学发光免疫分析

用红细胞代替辣根过氧化物酶作为双抗体夹心免疫分析中第二抗体的标记物,建立了一种红细胞标记抗体的免疫化学发光测定乙型肝炎病毒表面抗原的新方法.在免疫反应完成后,结合了抗原-抗体免疫复合物的致敏红细胞在低渗溶液中溶血,释放出血红蛋白.基于血红蛋白对鲁米诺-H2O2体系化学发光具有催化作用的原理,采用化学发光法测定血红蛋白含量.测得的血红蛋白发光强度与待测抗原浓度呈线性关系.采用这种方法可检测出0.5 ng/mL的乙型肝炎病毒表面抗原.将该方法与酶联免疫吸附分析(ELISA)结合起来对乙型肝炎患者血清乙肝病毒表面抗原(HBsAg)进行检测,两者符合率均为97%,表明本法具有良好的灵敏度和特异性,可用于临床标本测试.

基于快速定点突变研究含硒人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶1c-1c的催化活性

先将人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶1c-1c(hGSTZ1c-1c)中非催化中心的Cys-137,Cys-154,Cys-165和Cys-205突变为Ser,然后将催化中心14,15和17位的3个氨基酸残基突变为Cys,再利用半胱氨酸缺陷型大肠杆菌表达系统将其特定地转化为Sec,即把GPx的催化基团引入到hGSTZ1c-1c中,高效地获得了具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力的模拟酶.其中制备的3个含硒突变体15C,14C/15C和17C均显示出明显的GPx活力.对非含硒突变体性质研究发现,Ser-14或Ser-15任何一个残基发生突变都会导致hGSTZ1c-1c的GST活力几乎丧失,表明Ser-14和Ser-15在催化反应中发挥着重要作用,但前者主要参与底物结合,后者更侧重于催化.

单链抗体2F3表达条件的优化及其提纯和性质研究

将构建好的单链抗体 2F3表达载体pTMF2F3ScFv转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)。先挑选出表达量高的单克隆 ,然后让其在 37℃进行表达 ,并将表达时的培养条件进行优化。实验结果表明 :最佳诱导条件为开始诱导时的菌体密度OD590nm =1.0～ 1.8,所加异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)的浓度为 0 3～ 0 5mmol L ,诱导时间 7h ,优化后目的蛋白表达量占菌体总蛋白的 2 0 % ,并用发酵罐成功地进行了扩大培养 ,筛选了洗涤包涵体的最佳条件。采用两步法对包涵体复性进行了研究 ,用Westernblotting及ELISA法检测了所表达的单链抗体及其生物活性 。

人参不同部位皂甙对失血性休克犬血清LDH及红细胞脆性的实验观察

本文应用人参不同部位皂甙(果皂甙、花蕾皂甙、芦头皂甙)预治疗失血性休克犬。发现三种不同部位皂甙都降低失血性休克犬血清乳酸脱氢酶(LDH)的活力,降低红细胞膜的脆性,具有明显的抗休克作用。