对细粒棘球绦虫EgM123基因进行分子克隆和生物信息学分析,同时对EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平进行初步研究。采集绵羊肝脏包囊中原头蚴,提取总RNA,通过RT-PCR获取EgM123纯化的PCR产物,克隆到pGEM-T载体并测序,对测序结...对细粒棘球绦虫EgM123基因进行分子克隆和生物信息学分析,同时对EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平进行初步研究。采集绵羊肝脏包囊中原头蚴,提取总RNA,通过RT-PCR获取EgM123纯化的PCR产物,克隆到pGEM-T载体并测序,对测序结果进行结构和功能的预测分析。以Actin基因为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术,对不同发育阶段,即其原头蚴和成虫的EgM4、EgM9、EgM123的表达量进行检测。结果表明,EgM123基因ORF为594bp,编码197个氨基酸,蛋白分子质量为21.959ku,等电点为7.94。EgM123蛋白无信号肽、跨膜螺旋区和卷曲螺旋结构,是一种亲水性的可溶性蛋白质,存在23个磷酸化位点。根据亚细胞定位预测显示,EgM123蛋白主要位于细胞核内。二级结构预测含α-螺旋9.64%、β-折叠22.84%、无规则卷曲62.94%。EgM123氨基酸序列中有6个潜在的抗原表位。RT-qPCR结果显示,成虫阶段EgM家族基因表达量极显著高于原头蚴阶段。在发育的同一阶段,EgM123基因极显著高于EgM4、EgM9基因的表达量。通过EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平,EgM123基因在虫体成虫阶段高表达,以期为筛选细粒棘球绦虫终末宿主疫苗候选基因提供理论依据。展开更多
本研究为高效构建狂犬病SRV9ψ区缺失株感染性cDNA克隆,在细胞内进行重组狂犬病病毒的拯救提供帮助。按照Isothermal in vitro recombination system or"Gibson Assembly"连接方法设计引物,分别扩增得到去除狂犬病SRV9标准疫...本研究为高效构建狂犬病SRV9ψ区缺失株感染性cDNA克隆,在细胞内进行重组狂犬病病毒的拯救提供帮助。按照Isothermal in vitro recombination system or"Gibson Assembly"连接方法设计引物,分别扩增得到去除狂犬病SRV9标准疫苗株的伪基因区(ψ区)的首尾均存在互补序列的5个结构蛋白基因的目的片段。利用T5核酸外切酶、DNA聚合酶及T4连接酶的协同作用,两步即可获得狂犬病SRV9ψ区缺失株的感染性cDNA。本研究利用Gibson Assembly连接法成功高效构建了狂犬病SRV9ψ区缺失株的感染性cDNA。此方法避免了传统的酶切连接方法中繁琐的实验步骤,实现了多个基因片段间的无缝连接,大大提高了载体构建的效率,为进一步研究狂犬病病毒的基因功能提供高效的方法。同时也为Gibson Assembly法应用于其它载体的构建提供借鉴。展开更多
文摘对细粒棘球绦虫EgM123基因进行分子克隆和生物信息学分析,同时对EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平进行初步研究。采集绵羊肝脏包囊中原头蚴,提取总RNA,通过RT-PCR获取EgM123纯化的PCR产物,克隆到pGEM-T载体并测序,对测序结果进行结构和功能的预测分析。以Actin基因为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术,对不同发育阶段,即其原头蚴和成虫的EgM4、EgM9、EgM123的表达量进行检测。结果表明,EgM123基因ORF为594bp,编码197个氨基酸,蛋白分子质量为21.959ku,等电点为7.94。EgM123蛋白无信号肽、跨膜螺旋区和卷曲螺旋结构,是一种亲水性的可溶性蛋白质,存在23个磷酸化位点。根据亚细胞定位预测显示,EgM123蛋白主要位于细胞核内。二级结构预测含α-螺旋9.64%、β-折叠22.84%、无规则卷曲62.94%。EgM123氨基酸序列中有6个潜在的抗原表位。RT-qPCR结果显示,成虫阶段EgM家族基因表达量极显著高于原头蚴阶段。在发育的同一阶段,EgM123基因极显著高于EgM4、EgM9基因的表达量。通过EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平,EgM123基因在虫体成虫阶段高表达,以期为筛选细粒棘球绦虫终末宿主疫苗候选基因提供理论依据。
文摘本研究为高效构建狂犬病SRV9ψ区缺失株感染性cDNA克隆,在细胞内进行重组狂犬病病毒的拯救提供帮助。按照Isothermal in vitro recombination system or"Gibson Assembly"连接方法设计引物,分别扩增得到去除狂犬病SRV9标准疫苗株的伪基因区(ψ区)的首尾均存在互补序列的5个结构蛋白基因的目的片段。利用T5核酸外切酶、DNA聚合酶及T4连接酶的协同作用,两步即可获得狂犬病SRV9ψ区缺失株的感染性cDNA。本研究利用Gibson Assembly连接法成功高效构建了狂犬病SRV9ψ区缺失株的感染性cDNA。此方法避免了传统的酶切连接方法中繁琐的实验步骤,实现了多个基因片段间的无缝连接,大大提高了载体构建的效率,为进一步研究狂犬病病毒的基因功能提供高效的方法。同时也为Gibson Assembly法应用于其它载体的构建提供借鉴。