细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒

目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒。方法 :CD、TK融合基因CDglyTK自载体 pWZLneoCDglyTK中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 pAdtrackCMV CDglyTK ,将之PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒 pAdeasy 1共转化BJ5 183菌 ,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA ,PacI酶切后转染 2 93细胞包装成腺病毒颗粒 ,采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,利用报告GFP基因对病毒滴度和感染效率进行测定 ,WesternBlot检测感染腺病毒的肿瘤细胞中有无目的基因的表达。结果 :由pAdTrack CMV CDglyTK和 pAdeasy 1共转化BJ5 183菌 16～ 2 0h后 ,可获得 30 %左右的阳性重组体细菌克隆 ,由重组体克隆质粒DNA转染 2 93细胞包装产生的重组体腺病毒 ,经PCR检测表明已含有目的基因 ,且无复制能力腺病毒的存在。纯化所得腺病毒滴度约为 8× 10 12 pfu/L ,当MOI =10 0时 ,腺病毒感染HepG1细胞的效率 >75 % ,WesternBlot证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达。结论 :细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的Ad CDglyTK在体外能有效表达相应的基因产物 ,为今后的深入研究奠定了基础。

细菌内同源重组法制备mIL-12腺病毒载体及其体外高效表达

利用细菌内同源重组法构建含 m IL- 1 2双顺反子重组腺病毒载体 ,其中由 polio IRES连接的 m IL- 1 2 p40和 p35双亚基目的基因片段用 Not +Xho 酶自真核表达载体 pc DNA3/m IL- 1 2中切出 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 p Adtrack- CMV/m IL- 1 2 ,对之线性化后与腺病毒基因组质粒 p Adeasy- 1共转化 BJ51 83菌 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒DNA,转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒 Ad- m IL - 1 2 . Southern杂交证实 ,p40和 p35基因已被克隆至 Ad- m IL - 1 2基因组中 ;RT- PCR结果显示 ,Ad- m IL- 1 2感染的 MM45T· Li肿瘤细胞中有p40和 p35基因的表达 ,ELISA检测感染 48h细胞的上清中 m IL- 1 2的含量达 88ng每 1 0 6细胞 ,其体外能刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖 ,提高 NK细胞活性及诱导 干扰素的产生 .结果表明 ,利用细菌内同源重组法制备的 Ad- m IL- 1 2重组腺病毒载体是一种方便、高效、成功率高的方法 ,所制备的重组体腺毒在体外能有效表达具有生物活性的 m IL- 1 2 ,为今后的体内应用奠定了基础 .

小鼠Egr-1基因启动子的克隆及其辐射诱导基因表达

研究克隆小鼠Egr 1基因启动子及其辐射诱导基因表达特性。方法 :用合成的一对引物 ,以BALB c小鼠基因组为模板 ,扩增出 44 9bp大小含 6个CC(A T) 6 GG基序的序列 ,通过亚克隆技术分别将其插入pBluescriptⅡ测序载体和pHGFP S6 5T报告载体中。利用测序载体对克隆的DNA序列进行分析 ,报告质粒载体经Li pofecTAMINE脂质体介导转染COS 7细胞后给予γ射线照射或H2 O2 处理 ,用流式细胞仪观察GFP表达阳性细胞数。结果 :PCR扩增的DNA片段经测序证实与文献报道完全一致 ,报告质粒转细胞实验结果提示 ,照射或H2 O2 处理可经Egr 1基因启动子而诱导GFP(绿色荧光蛋白 )的表达。结论 :成功地克隆了Egr 1基因启动子 ,经照射能诱导报告基因GFP的表达 。

小剂量X线全身照射抗肿瘤转移的剂量效应

小剂量Ｘ线全身照射抗肿瘤转移的剂量效应魏道严，黄帼，金敖兴，汪思应小剂量电离辐射的刺激效应是近年来放射生物学研究的热点之一。其对种植性肿瘤生长的抑制作用已见报道，但其对肿瘤转移的影响尚未见有系统研究。本文以Ｂ１６黑色素血道转移为模型，观察小剂量Ｘ线单...

恶性肿瘤基因治疗联合放射治疗研究进展

恶性肿瘤基因治疗是近年来的研究热点,但其临床疗效并不令人满意,这可能与基因治疗技术中存在的基因靶向转移困难、基因转移效率低、转移后基因的表达缺乏有效调控手段以及肿瘤病因复杂,缺乏有效目的基因等因素有关.本文就近年来基因治疗联合放射治疗,以期解决基因治疗、放射治疗中存在的问题,提高肿瘤治疗总体效果的研究进展作一综述.

软X线接触显微术观察细胞形态结构

本文简要地介绍了软X线接触显微术SXCM的技术原理及其特点,结合作者的工作实际,较详细地描述了该技术的实验方法。根据有关资料,分析了该技术的应用前景及存在的问题。

小剂量X线全身照射对不同荷瘤时间小鼠的抗肿瘤转移效应

采用肿瘤血道转移模型，选用Ｂ１６黑色素瘤和Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）两种类型细胞，就小剂量Ｘ线全身照射对不同荷瘤时间小鼠的抗肿瘤转移效应进行研究。结果发现，于静脉注射Ｂ１６黑色素瘤或ＬＬＣ细胞后２４ｈ（Ｂ组）或第１３天（Ｃ组）接受７５ｍＧｙＸ线全身照射小鼠的肿瘤肺转移结节数明显低于未照射组（Ａ组）（Ｐ＜０．０５～０．００２）。比较不同照射时间的抗肿瘤转移效果时发现，静注Ｂ１６黑色素瘤的Ｂ组肺转移结节数仅为Ｃ组的５９％，而ＬＬＣ的Ｂ组则为其Ｃ组的７１％。检测注射Ｂ１６黑色素瘤第１４天各组小鼠的免疫功能时发现，Ｂ、Ｃ两组ＮＫ、ＬＡＫ细胞活性及脾细胞对ＩＬ－２反应性明显高于Ａ组（Ｐ＜０．０５～０．００１）。上述结果提示：小剂量Ｘ线全身照射提高荷瘤小鼠的免疫功能可能是其抗肿瘤转移作用的主要机制之一。

75 mGy X线全身照射对小鼠脾细胞抗瘤活性的增强作用

将经７５ｍＧｙＸ线全身照射后小鼠的脾细胞过继转移至同系小鼠体内，观察其对肿瘤生长及转移的影响，结果发现，照射组小鼠脾细胞可明显抑制与之混合注射的Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）细胞的生长和自发肺转移（Ｐ＜０．０５～０．０１）。与假照组相比，照射后２４ｈ照射组小鼠脾脏有核细胞数增多（Ｐ＜０．０２），脾细胞对ＣｏｎＡ和ＩＬ－２的反应性增强（Ｐ＜０．００１），ＮＫ细胞毒活性明显提高（Ｐ＜０．０１）。提示，脾细胞免疫功能的增强，可能是小剂量Ｘ线全身照射后脾细胞抗瘤活性提高的重要原因。

小剂量辐射影响B16黑色素瘤血道肺转移作用机制研究

Ｃ５７ＢＬ／６小鼠经７．５ｃＧｙＸ线全身照射后２４ｈ静脉注射１２５ＩＵｄＲ标记的Ｂ１６黑色素瘤细胞，２４ｈ后测定肺活瘤细胞存留率时发现，照射组小鼠的肺活瘤细胞存留率明显降低。与此同时，于照射后２４ｈ检测小鼠的免疫功能发现，照射组小鼠脾脏有核细胞数明显增多，脾细胞ＮＫ细胞毒活性及体内巨噬细胞功能均显著增强。结果提示，小剂量辐射可能通过提高ＮＫ细胞、巨噬细胞功能而加速肺肉瘤细胞的清除速率。

小剂量X线全身照射对小鼠免疫功能的影响

就75mGyX线全身照射对小鼠免疫功能的影响进行了研究.结果发现,与未照射的对照组相比,照射后24h小鼠脾及胸腺有核细胞数明显增加(P<0.05),巨噬细胞功能增强(P<0.01),脾细胞NK细胞毒活性及其对ConA的反应性明显提高(P<0.01).上述结果提示,小剂量X线全身照射可对机体的免疫机能产生刺激作用.

免疫金标记肿瘤细胞表面抗原的软X射线接触显微术观察

在建立了适于软Ｘ射线接触显微术（ＳＸＣＭ）观察的细胞样品免疫细胞化学染色技术的基础上，对培养的Ｈｅｏ—２肿瘤细胞表面ＨＬＡ—Ａ抗原进行免疫金银染色，并应用ＳＸＣＭ观察．结果显示：肿瘤细胞表面抗原的免疫金银染色颗粒图像反差明显，立体感强，大小和形态各异的颗粒清晰易辨．

细胞样品的高分辨率软X射线接触显微术图像的研究

在建立适于软Ｘ射线接触显微术（ＳＸＣＭ）观察细胞样品制备方法的基础上，以培养的肿瘤细胞为生物样品，应用细聚焦软Ｘ射线光源进行ＳＸＣＭ研究，获得了分辨率优于２８ｎｍ的高质量肿瘤细胞ＳＸＣＭ图像。

未染色未固定完整人喉癌细胞的软X线接触显微术观察

应用软X线接触显微术(SXCM)观察了未染色、未固定、完整的人喉癌细胞(Hep—2)形态结构。较之光学显微镜的细胞原物,SXCM复型的SEM放大像显示更多较清晰的细微结构,图像的立体感强。在高分辨率SXCM复型的TEM放大像中,所显示的胞浆结构特征不同于TEM下的胞浆结构。结果表明:与常规的显微技术相比,SXCM有其独特的优点,它为我们从不同的角度更深刻地认识细胞形态结构的特点提供了新的途径。

影响软X线接触显微术实验结果因素的初步研究

以培养的肿瘤细胞为观察对象。对影响软X线接触显微术(SXCM)图像质量的因素进行了分析、讨论。这些因素包括:细胞样品的制备、软X线光源的性能、显影深度的控制及后继放大的实验条件等。同时,作者还对某些因素提出了一些相应的解决办法。

低水平辐射对小鼠免疫功能影响的体内体外研究

从体内体外观察７５ｍＧｙＸ线全身照射对小鼠免疫功能的影响，发现照射后小鼠胸腺和脾的有核细胞数增多，体外检测胸腺细胞对３Ｈ—ＴｄＲ的掺入增加，脾细胞对ＣｏｎＡ和ＩＬ—２的反应性及其ＮＫ活性均显著提高．整体条件下检测照射组小鼠的巨噬细胞功能增强，肺内Ｂ１６黑色素瘤的转移结节数明显降低。上述结果提示，７５ｍＧｙＸ线全身照射可刺激多种免疫细胞功能，提高机体免疫功能的总体水平。

慢性阻塞性肺部疾病患者肺泡巨噬细胞内cAMP和cGMP变化

检测７２例慢性阻塞性肺部疾病（ＣＯＰＤ）患者及２６例正常人血、支气管肺泡泡洗液（ＢＡＬＦ）和肺泡巨噬细胞（ＡＭ）内ＣＡＭＰ和ｃＧＭＰ。结果表明：（１）正常人与ｃＯＰＤ患者外周血ｃＡＭＰ及ｃＧＭＰ无明显差异。（２）慢性支气管炎患者支气管及肺泡灌洗液中ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ明显降低，（３）皮质激素较舒喘灵更能改善ｃｏＰＤ患者ＡＭ内ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ水平。

低剂量X线全身照射对小鼠移植瘤的防治作用及机制初探

本文利用Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）自发肺转移模型及Ｂ１６黑色素瘤（Ｂ１６Ｍ）实验性肺转移模型，研究了低剂量Ｘ线（７５ｍＧｙ，１２．５ｍＧｙ／ｍｉｎ×６ｍｉｎ）全身照射小鼠对其肿瘤生长和转移的影响。实验发现：受照组荷瘤鼠ＬＬＣ生长及自发肺转移明显低于对照组（Ｐ＜０．０１），ＬＬＣ、Ｂ１６Ｍ实验性肺转移也明显降低；预用Ｘ线照射对其肿瘤生长和转移也有预防作用。提示小剂量Ｘ线可能通过提高小鼠免疫功能来防治肿瘤的生长和转移。

肿瘤接种前、后低电离辐射对肿瘤转移的影响

Ｃ５７ＢＬ小鼠接受２５、５０、７５、１００ｍＧｙＸ线单次全身照射后，小鼠肺转移结节数明显低于对照组，其中以７５ｍＧｙ组最低。再将荷瘤小鼠进行７５ｍＧｖＸ线照射，受照组肺转移结节数仍低于对照组。与此同时发现，经７５ｍＧｙ照射的小鼠免疫功能明显增强。上述结果提示：小剂量电离辐射对肿瘤转移有抑制作用，其可能机制是其免疫刺激效应。

小鼠75mGyX线全身照射对肿瘤细胞清除率的影响

７５ｍＧｙＸ线全身照射后，小鼠肝、脾等器官对肿瘤细胞清除率有明显提高。注入肿瘤细胞后２４ｈｒ肺、肝、脾中肿瘤细胞残留率照射组比对照组明显减少（Ｐ＜０．０１），肺部肿瘤转移结节也明显减少。有关免疫学指标检测结果表明，７５ｍＧｙＸ线全身照射后，机体巨噬细胞（Ｍ）吞噬作用、脾脏细胞ＮＫ活性和ＣｏｎＡ刺激的淋巴细胞掺入率（ＬＴＲ）明显提高或增强。实验结果提示，低剂量Ｘ线照射后小鼠机体对肿瘤细胞清除率的提高是通过激活体内抗肿瘤免疫功能而实现的。