抗结核DC疫苗的初步研究

目的:研制抗结核的新型疫苗(DC疫苗)。方法:无菌分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,以rGM-CSF及rIL-4诱导分化获得树突状细胞(DC),以pEGHsp65融合质粒转染DC,共聚焦激光扫描显微镜检测转染率,继以电镜鉴定细胞形态、流式细胞术分析组合性表面分子表达、混合淋巴细胞反应(MLR)检测体外刺激T细胞增殖的功能。将制备的DC疫苗静脉接种正常同系小鼠,分别取各脏器冰冻切片后荧光显微镜观察;取小鼠静脉血用ELISA法检测IL-12及IFN-γ的表达量。结果:24 h DC转染率约20%,电镜可见细胞呈典型毛刺状突起,流式细胞分析表明转染后的DC表面MHCⅡ、33D1的表达量均呈显著增高。MLR显示,pEGHsp65转染DC组与pEG-FP-C1转染DC组及空白DC组比较呈统计学增高。脏器冰冻切片显示,接种pEGHsp65转染DC小鼠组及pEG-FP-C1转染DC小鼠组与未转染DC组比较,在各脏器分布中,以脾脏分布显著增高。其余脏器分布无显著差别。pEGHsp65转染DC小鼠组IL-12及IFN-γ表达量显著高于pEGFP-C1转染DC小鼠组及未转染DC小鼠组,P<0.05,未转染DC组与阴性对照组相比,IL-12及IFN-γ表达量也有统计学增高,P<0.05。结论:pEGHsp65制备的DC疫苗具有成熟表型及功能,能够刺激小鼠IFN-γ及IL-12分泌增高。

结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备

目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGHsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测Hsp65mRNA的表达。以pEGHsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株Hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到Hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGHsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。

生物制剂注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白穴位注射治疗强直性脊柱炎42例临床观察

目的:观察生物制剂注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(强克)穴位注射治疗强直性脊柱炎的临床疗效和安全性。方法:将62例强直性脊柱炎患者分为治疗组42例和对照组20例。治疗组采用生物制剂强克次髎穴穴位注射治疗,每次50 mg,每周1次;对照组使用同等剂次强克常规皮下注射治疗。2组均以12周为1个疗程。观察2组患者治疗前后症状、体征、Bath强直性脊柱炎功能指数(BASFI)、脊柱痛评分、夜间痛评分、总体评分(PGA)、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)及相关不良反应。结果:治疗1周、12周后,与治疗前比较,2组PGA、BASFAI、ESR、CRP均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组改善程度优于对照组(P<0.05)。治疗1周后,治疗组达到ACR20、ACR50、ACR70改善的患者分别为36例(85.71%)、28例(66.67%)、18例(42.86%),优于对照组的12例(60.00%)、8例(40.00%)、4例(20.00%)(P<0.05);治疗12周后,治疗组达到ACR20、ACR50、ACR70改善的患者分别为40例(95.24%)、35例(83.33%)、33例(78.57%),优于对照组的15例(75.00%)、11例(55.00%)、10例(50.00%)(P<0.05)。2组不良反应均较轻微,治疗组3例,对照组2例出现注射部位反应。结论:采用生物制剂强克穴位注射治疗强直性脊柱炎患者临床效果显著,优于常规皮下注射,安全性和耐受性好,为中西医结合治疗提供临床经验。

BioPlex 2200全自动免疫分析仪检测血清中抗双链DNA抗体的临床应用

目的分析比较BioPlex 2200全自动免疫分析仪和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中抗双链DNA(dsDNA)抗体的灵敏度、特异度及其优缺点。方法采用BioPlex 2200和ELISA检测101例纳入研究者的血清抗dsDNA抗体。纳入研究者中49例为临床确诊的系统性红斑狼疮患者,52例作为对照(包括32例其他结缔组织病患者和20例体检健康者)。结果BioPlex 2200检测抗dsDNA抗体的灵敏度为57.14%,特异度为94.23%;ELISA检测抗dsDNA抗体的灵敏度为53.06%,特异度为96.15%。两种方法总体符合率为95.05%,χ2检验分析,差异无统计学意义(χ2=78.69,P>0.05),Kappa值评价一致性较好(Kappa=0.880)。BioPlex 2200检测抗dsDNA抗体,3组抗dsDNA抗体水平比较,差异有统计学意义(F=61.52,P<0.05)。结论BioPlex 2200和ELISA检测血清抗dsDNA抗体结果有较好的一致性,检测迅速,值得临床推广应用。

结核分枝杆菌诱导宿主巨噬细胞凋亡机制初探

目的探讨结核杆菌感染中巨噬细胞凋亡的信号传导通路及分子机理。方法用透射电镜、荧光染色对凋亡细胞的形态特征进行分析;琼脂糖凝胶电泳检测巨噬细胞DNA片段化水平;流式细胞术测定不同时期小鼠巨噬细胞凋亡率、膜表面Toll样受体2(TLR2)和胞内Bcl2蛋白的水平。结果结核杆菌强毒力株H37Rv感染组的巨噬细胞凋亡率在1～7d内逐渐升高,至7d时最高可达32.2%,感染的9～11d以后,凋亡率逐渐降低;H37Rv感染组Bcl2水平于感染9～11d后逐渐升高,与卡介苗(BCG)组比较差异有统计学意义;H37Rv感染组和BCG组的巨噬细胞膜表面的TLR2水平均高于正常对照组;各组组内不同时期的TLR2水平无明显变化。结论结核杆菌H37Rv株在感染的早期对宿主巨噬细胞有较强的致凋亡作用,而Bcl2表达的增加能显著抑制这种凋亡。结核杆菌在体内感染过程中,TLR2蛋白可能与巨噬细胞凋亡及Bcl2表达无关。