马鼻肺炎诊断方法研究进展

马鼻肺炎的病原是马疱疹病毒l型和马疱疹病毒4型,属于疱疹病毒目,疱疹病毒科,a疱疹病毒亚科,通常会引起呼吸道疾病和病毒性流产,严重时引发神经性疾病。该病毒在世界范围内流行,对养马业和赛马业的危害很大。本文总结国内外近些年关于马疱疹病毒的病原学和血清学诊断方法的研究成果,了解国际上关于马鼻肺炎检测诊断方法的研究进展,为出入境赛马的马鼻肺炎的检验检疫提供可靠的检测方法。

应用地高辛标记的PCR-ELISA技术快速检测转基因水稻

应用地高辛标记的PCR-ELISA(Dig-PCR-ELISA)技术进行转基因水稻检测研究。针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子(p35S)、胭脂碱合成酶(NOS)终止子(Tnos),筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因(hpt,hpt)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、抗草丁膦除草剂基因(bar),建立Dig-PCR-ELISA检测方法;能进行半定量检测,敏感性试验表明,Dig-ELISA检测比常规电泳检测可提高敏感性达1 000倍,可检测含量达0.1％的GMO样品。全过程可在24 h内完成。

不同佐剂免疫原对猪旋毛虫病的免疫保护作用比较研究

采用７ 日龄旋毛虫成虫可溶性抗原与弗氏完全佐剂（ＦＣＡ） 、白油司班佐剂、ＩＳＡ２０６佐剂和蜂胶佐剂乳化制备免疫原，对试验猪腹腔注射免疫３ 次，每次间隔７ｄ ，每头猪的免疫剂量为０５ｍｇ。最后一次免疫后７ｄ 攻击感染旋毛虫肌幼虫２００ 条／ｋｇ 体重。于感染后第３５ｄ 和第１２０ｄ 剖杀试验猪，用消化法检查计算每克肌肉的荷虫数。结果４ 种佐剂免疫猪肌幼虫的减虫率分别为９６１２ ％ 、８７９７ ％ 、８９８４ ％ 和９５１５ ％ ，其中以ＦＣＡ 和蜂胶佐剂免疫组的保护作用最好。表明４ 种佐剂均具有免疫增强作用，而蜂胶佐剂在乳化程序、注射、价格及免疫增强作用等方面都优于其它佐剂，更具有开发应用前景。

广州口岸进口海鱼的异尖线虫幼虫感染情况调查

异尖线虫病是由食人异尖线虫科某些属的活的第三期幼虫感染而引起的．最早由荷兰的VanThiel报道．随后大量病例在日本、韩国和法国等国家出现．该病属于海洋自然疫源性疾病．大量存在于海洋动物中。到目前为止根据报道可以感染人的异尖线虫主要有六种，即典型异尖线虫（A．typica）、简单异尖线虫（Anisakis simplex）、对盲囊线虫（Contracaccum spp．）、宫脂线虫（Hysterothylacium spp．1、抹香鲸异尖线虫（A．physeteris）和拟地新线虫（Pseudoterranova decipiens）。

禽波纳病毒分离鉴定及其恒温扩增检测分析

利用腺胃扩张症(PDD)患病鹦鹉腺胃RT-PCR阳性病料,接种猪睾丸(ST)传代细胞,分离禽波纳病毒(ABV),建立实时RT-LAMP检测方法。将阳性病料接种ST细胞单层传代,出现细胞圆缩、脱落,ABV基质蛋白(M)基因扩增产物出现预计大小351bp条带,测序后进化树分析显示为ABV5基因型。针对M基因设计ID37、ID30、ID19、ID6和ID1共5组引物,后3组引物RT-LAMP呈阳性反应。利用钙黄绿素建立实时RT-LAMP,分别在36(ID30)、38(ID37)和49(ID19)min出现扩增反应曲线,60min内扩增达到峰值。对各种临床样品检测与RT-PCR结果一致,新城疫等类症病毒未见阳性反应,显示较高的特异性;对细胞培养物检测10-1～10-5为阳性,比较RT-PCR敏感性提高约100倍。RT-LAMP检测方法的建立为PDD防制提供新的检测方法,也是波纳病公共卫生研究有益的参考。

猪日本脑炎病毒NS3基因实时RT-LAMP快速检测方法的建立

建立日本脑炎病毒一步法实时环介导逆转录等温快速扩增方法。根据日本脑炎病毒序列保守的非结构区基因NS3设计4条特异引物,用于扩增SA14-14-2株、SA103株和GD06株日本脑炎病毒获得成功,在病毒感染的单层细胞和猪体内都可以检出病毒。与常规SYBR GreenI适时荧光RT-PCR方法比较和Ct值分析,用不同稀释度病毒RNA,两者敏感性相似,适时RT-PCR在模板浓度低时结果更稳定。FIP和BIP纯度会影响反应效果,反应时间和模板浓度会影响电泳条带。一般63℃～65℃30min可出现结果,模板浓度低时要适当延长反应时间。以SYBR GreenI为指示剂,RT-LAMP在63℃～65℃循环扩增检测日本脑炎病毒,1.5min/循环,30个循环,Ct值为21.5。提示RT-LAMP方法用于日本脑炎诊断、鉴别,是敏感、可靠、成本低廉的方法,有助于人畜日本脑炎的防控工作。

微量补体结合试验检测牛、羊副结核病的研究

采用《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》"副结核病补体结合试验操作规程"方法(简称常量法)和微量补体结合试验(简称微量法)检测3677头进口牛羊的副结核病抗体并进行比较。结果表明,常量法和微量法的溶血素效价测定值相同,补体效价测定值近似,阴性血清对照、抗原对照、补体对照、红细胞对照、血清抗补体结合对照结果均相同,阳性对照血清效价微量法比常量法提高1个滴度,被检血清的阳性检出率微量法高于常量法。比较37℃水浴及37℃恒温培养箱环境下的微量法补体结合试验结果,溶血素效价、补体效价、各项对照试验结果完全相同,被检血清在37℃水浴反应更加充分。比较用变态试验和补体结合试验检验3677头牛羊副结核病的结果、以及用补体结合试验、变态反应和酶联免疫吸附试验方法同时检测2024头牛的结果,发现它们的相关性很小。

戊型肝炎病毒一步法多重荧光定量PCR分型鉴定技术的建立及应用

为建立鉴别检测戊型肝炎病毒(HEV)各基因型的方法,本研究基于HEV1、HEV3和HEV4的基因组序列,设计一对保守扩增引物和3条型特异性探针,通过体系优化,建立了用于鉴别检测不同型HEV感染的多重荧光定量PCR方法,并以绿色荧光蛋白(EGFP)为内部质控,确保整个诊断流程的准确和有效。特异性试验结果显示该方法仅对HEV扩增为阳性,而对甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、疱疹病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒等核酸扩增均为阴性,特异性好。敏感性试验结果显示,该方法对HEV 1、HEV3和HEV 4的最低检测限均为50个基因组拷贝/反应,敏感性高。分析表明一步法多重荧光定量PCR对不同浓度的HEV 1、HEV3和HEV4重复性试验的变异系数均小于4%,表明该方法具有良好的检测重复性和稳定性。对采集自浙江、安徽、江西、上海和福建省等地区的猪粪便、猪血清和人血清等临床样品进行检测,其结果与传统套式PCR及测序的鉴定结果一致,表明该多重荧光定量PCR对于临床样品的检测具有高准确性,可用于临床HEV隐性感染或早期感染的快速检测。本研究为该病的有效治疗奠定基础。

马红球菌菌落印迹检测方法的建立

为建立快速检测环境中马红球菌(R.equi)的方法,本研究以非致病性R.equi ATCC6939以及致病性R.equi毒力相关脂蛋白A(Vap A)分别免疫家兔,制备了兔抗非致病性R.equi多抗与兔抗致病性R.equi Vap A蛋白多抗,并以其作为检测抗体,通过优化反应条件,建立了R.equi菌落印迹检测方法。结果显示该方法可特异性检测R.equi并可区分致病性与非致病性R.equi;其R.equi检测敏感性高,特异性强,均明显优于R.equi的PCR鉴定法。利用本研究建立的方法对全国部分地区马场土壤样本的初步调查表明R.equi在部分地区马场土壤中普遍存在,然而未检测到致病性R.equi。本实验建立的检测方法可应用于我国马场环境中R.equi的流行病学调查,为我国马病防控平台提供有力的技术支持,并为中国现代育马场的建设提供必要的参考。

马红球菌VapA蛋白的表达及其间接ELISA检测方法的建立

为建立检测马红球菌(R.equi)抗体的方法,本研究对致病性R.equi的标志性抗原毒力相关脂蛋白A(VapA)进行融合表达,并以纯化的VapA重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立了R.equi血清VapA抗体间接ELISA检测方法。结果表明:该方法仅与马VapA阳性血清发生特异性反应,而与H3N8马流感、马鼻肺炎、马传染性贫血抗血清无交叉反应,具有较强的特异性;并且其批内和批间变异系数均小于15%,具有较好的重复性和稳定性。该检测方法的建立可以应用于我国马群R.equi血清流行病学的调查,为我国马病防控平台提供基础依据和数据支撑。

检测猪乙型脑炎抗体胶体金免疫层析法的建立与初步应用

利用蔗糖密度梯度超速离心浓缩纯化vero细胞培养SA14-14-2株猪乙脑病毒灭活抗原,进行胶体金点样和配比优化,制备GICA试纸条。结果最优浓缩样品配比构成是PBS 1.32 mL、灭活病毒液24 mL、30%蔗糖2.6 mL、55%蔗糖6.6 mL;用于胶体金偶联的抗原浓度约2.80 mg/mL。试纸条能明显区别阴阳性血清,阳性血清稀释1:256能显示条带,优化后灵敏度达到1:1024。与猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、Ⅱ型圆环病毒病阳性血清不发生交叉反应。用于检测2群免疫母猪抗体阳性率分别为86%和100%,说明疫苗免疫效果较好;检测未经免疫肉猪出现阳性结果,分别达到38%和24%,说明存在病毒隐形感染。

供港澳猪场乙型脑炎血清流行病学调查及与人群感染的关系

流行性乙型脑炎是一种重要的人兽共患病毒病,成年动物和人往往呈隐性感染的带毒状态。为保障供港澳生猪的生产和卫生安全,本文以血净抑制试验调查了供港澳猪场人和猪的乙型脑炎血清抗体水平。结果各场猪群抗体阳性率分别达到57%、2.5%、39%、22%和93%。其中母猪群阳性率最高为87,%仔猪41%。各猪群平均抗体水平为1:38、1:15、1:39、1:20和1:107。同时,这些猪场的饲养人员均有乙型脑炎病毒感染,抗体阳性率分别为20%、11%、3.5%和24,%抗体水平为1:22、1:109、1:16。结果提出排除一些猪场已对猪只和人员进行乙脑疫苗接种的因素,在猪场中以善通存氏乙脑流行。加强乙型脑炎免疫接种的覆盖率,猪群采用细小-乙脑二联疫苗接种,人类特别是儿童要100%免疫接种乙脑疫苗,才能避免人猪间乙脑的相互传播。

禽流感病毒广东株HA基因BLSOM神经网络分型方法的建立

利用25个禽流感病毒及相关流感病毒广东株HA基因序列,建立三、四核苷酸特征基因片段BLSOM神经网络分型方法,对各片段数量进行统计和归一化处理。设计程序由MATLAB函数模拟人脑思维自组织学习,当训练步数为100及以上各毒株能成功聚类。H1、H3、H5、H7和H9亚型主要毒株分别归为一类,其中H3N2和H7N9毒株HA基因聚类图谱高度相似,表明这些毒株起源相同;不同年代H5N1毒株差异较大;H1N1和H9N2各1个毒株聚为一类,表明这两种病毒自然重组变异,为高危毒株筛查和溯源提供参考。

国际赛马进出境检疫的法律问题

为评估国内法律法规在国际赛马进出境检疫方面的适用性,将国际赛马跨境移动的特殊性与我国现行的动物检疫法律法规进行了对照,发现国内法律法规在此方面的适用性较差,建议修订完善相关法律,制订相应的技术规范。