氧化石墨烯修饰腐蚀型长周期光纤光栅的禽流感病毒免疫传感器

提出了一种使用基于氧化石墨烯修饰包层腐蚀型长周期光纤光栅应用于检测禽流感病毒的免疫传感器.氧化石墨烯通过氢键结合在包层腐蚀型长周期光纤光栅表面上,并通过共价键将禽流感病毒单克隆抗体与氧化石墨烯表面的羧基相结合.利用氧化石墨烯上吸附的禽流感病毒单克隆抗体与禽流感病毒抗原的特异性结合引起的长周期光纤光栅谐振波长变化进行检测.结果表明,该氧化石墨烯修饰包层腐蚀型长周期光纤光栅免疫传感器对禽流感病毒的检测极限为40 ng/mL,传感器的解离常数为~1.6×10^-7 mol/L,检测范围为40 ng/mL^200μg/mL.通过对禽流感病毒空白尿囊液、禽流感病毒尿囊液和新城疫病毒尿囊液进行检测,表明免疫传感器具有良好的特异性和临床性.该免疫传感器具有应用于禽流感病毒的快速和早期诊断的可能.

布鲁氏菌BP26蛋白的原核表达及鉴定

为了实现布鲁氏菌BP26蛋白在原核宿主细胞进行高效表达,对布鲁氏菌BP26基因进行密码子优化,化学合成了BP26全基因,并将其克隆至pET30a(+)载体上,构建重组质粒pET30a(+)-bp26,转化至基因工程菌BL21(DE3),利用IPTG进行诱导表达。利用His-tag镍柱纯化BP26重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果显示:重组质粒经Nde I与Xhol I双酶切,酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳显示与目的产物条带大小一致;当诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L,37℃诱导8 h时,重组蛋白的表达量最高;纯化后的目的蛋白经过Western Blot鉴定,显示在27.8 kD左右有一条明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。本研究成功实现了在大肠杆菌高效表达BP26蛋白,为后续布病检测新试剂的研制及疫苗的研发奠定了生物学基础。

sPD-L1蛋白原核表达、纯化及鉴定

为实现人可溶性程序性死亡因子配体1(solubleprogrammeddeathligand-1,sPD-L1)在原核表达系统的高效表达,根据GenBank发表的sPD-L1(GenBank登录号:AY254342.1)基因序列,在不改变sPD-L蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,化学合成PD-L1胞外域基因全长序列,克隆至质粒载体pET28a(+),转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行诱导表达,利用镍柱对目的蛋白进行纯化。纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE电泳、蛋白免疫印迹和酶联免疫吸附试验进行生物特性鉴定。结果表明:重组质粒经过NcoI、XholI双酶切鉴定显示在668bp处有一条特异性条带,与预期相符;当诱导条件为0.5 mmol/LIPTG、37℃、9h时,重组蛋白具有最高表达量。纯化产物经过Westernblot鉴定,结果显示在28KD左右有明显蛋白条带出现,而空白对照组则无条带。ELISA鉴定结果显示其可以与进口小鼠抗人PD-L1单克隆抗体发生较强的反应,说明已成功实现了在大肠杆菌中高效表达sPD-L1重组蛋白,可为后续开展sPD-L1检测方法的研究奠定基础。

氧化石墨烯集成腐蚀型81°倾斜光栅生物传感器

为了改善普通81°倾斜光纤光栅在生化检测中灵敏度低、检测极限不理想等问题,提出一种基于氧化石墨烯修饰腐蚀型81°倾斜光纤光栅的牛血清蛋白生物传感器,分析了该传感器的原理与传感特性.使用氢氟酸溶液腐蚀减小光栅直径,提高其对折射率的灵敏度,并用氧化石墨烯修饰光栅,然后将牛血清蛋白单克隆抗体固定于光栅表面,用于对牛血清蛋白的特异性检测.实验结果表明,氧化石墨烯集成腐蚀型81°倾斜光纤光栅生物传感器对牛血清蛋白的检测范围为0.15~15 nmol/L,检测极限为~0.165 nmol/L,其线性响应区域的灵敏度为~182 pm/(nmol·L^-1),传感器的检测范围较氧化石墨烯集成标准直径81°倾斜光纤光栅有所降低,但其灵敏度提高了5.3倍,且检测极限有较大的改善.

禽流感病毒HA蛋白的原核表达与鉴定

为了实现禽流感病毒血凝素(HA)蛋白在原核系统中高效表达,根据GenBank发表的HA(ID=DQ023145.1)基因序列,在不改变HA蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,化学合成HA全基因。将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-HA,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化HA重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析及Western-blot鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-HA/BL21(DE3)诱导条件为30℃、IPTG浓度为1mmol/L诱导8h时,HA蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后HA蛋白纯度较高,Westernblot实验发现在预期的70kD处有明显的蛋白印迹条带,说明已成功实现了在大肠杆菌中高效表达禽流感病毒HA蛋白,为后续开展禽流感检测方法及疫苗的研究奠定了基础。

H9N2禽流感病毒HA蛋白的原核表达与鉴定

为了实现H9N2亚型禽流感病毒的HA基因在原核系统中高效表达,试验参考GenBank发布的禽流感病毒A/chicken/Gansu/2/99(H9N2) HA基因序列(登录号为EF070733.1),优化该密码子,化学合成HA基因,并将该基因连接至pET-28a(+)质粒载体中,构建pET-28a(+)-HA重组质粒,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后诱导表达,并优化诱导温度(16,25,30,37℃)、IPTG诱导浓度(0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)及诱导时间(2,4,6,8,10 h),用His-tag镍柱亲和层析纯化HA蛋白,并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果表明:成功构建重组基因工程菌pET-28a(+)-HA/BL21(DE3),其在30℃条件下,添加IPTG终浓度为0.8 mmol/L,诱导6 h时,HA重组蛋白表达量最佳。经His-tag镍柱纯化后在预期的63 ku处出现蛋白印迹条带。说明HA蛋白在大肠杆菌中成功表达。

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。

牛支原体p30蛋白的原核表达与鉴定

为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30（登录号为AIA33998.1）基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a（＋）载体中,构建的重组质粒pET28a（＋）-p30转化至BL21（DE3）工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a（＋）-p30/BL21（DE3）诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明：当重组菌株pET28a（＋）-p30/BL21（DE3）诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。