流感病毒mRNA疫苗研究进展

流感严重威胁全球公共卫生并造成重大经济损失,预防流感最有效的措施是接种流感疫苗。流感病毒的抗原漂移和抗原转换,常导致疫苗株与流行株表面抗原不相匹配,其有效性显著降低。mRNA疫苗是一种比较安全的核酸疫苗,基因工程技术和新型递送系统的发展有力推动了流感mRNA疫苗的研究进程。mRNA疫苗平台有望成为快速、高效预防流感季节性流行和大流行的有力工具。

甲型流感病毒X31(H3N2)小鼠适应后毒力增强与HA及PB2突变相关

流感小鼠适应毒株及感染模型是研究流感病毒致病机理、评价抗流感病毒药物和疫苗效果的重要工具。为建立甲型流感病毒X31(H3N2)的鼠肺适应毒株,并探讨其在小鼠适应过程中毒力增强的分子机制,本研究将X31在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过观察病毒滴度测定、感染小鼠症状变化、体重改变和致死力等指标,发现X31经过鼠肺连续传代10次以后,病毒毒力逐渐增强,与原代病毒相比,鼠肺中病毒滴度提高10倍,半数致死量(50%lethal dose,LD50)提高大于1 000倍。确定获得高致病力的鼠肺适应毒株(Mouse adapted X31,X31MA);对X31MA毒株全基因组测序发现,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因出现3个有义突变(P221H、V309I、K411T),聚合酶碱性蛋白2(Basic protein 2,PB2)基因出现1个有义突变(M483T)。结果表明,通过在小鼠肺组织中连续传代X31(H3N2)致病力增强,其HA和PB2蛋白中四个适应性突变位点可能与流感病毒X31MA毒力增加相关。本研究为流感疫苗评价及致病机制研究提供了重要技术支持。

SARS-CoV-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2双价重组腺病毒载体疫苗可在小鼠诱导免疫保护

评价一种SARS-CoV-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2新型重组双价疫苗在小鼠模型中的免疫保护效果。本研究构建了表达SARS-CoV-2南非变异株(B.1.351)棘突蛋白1(S1)和H3N2柬埔寨分离株(A/Cambodia/e0826360/2020)血凝素(HA)的重组双价非复制Ad5载体疫苗,命名为HAdV5-S1-2A-HA,经单针肌肉注射免疫BALB/c雌鼠后,采用ELISA、血凝抑制实验、假病毒中和实验与Elispot实验进行体液与细胞免疫学检测,免后3~6周采用H3N2-X31病毒、H1N1-PR8与SARS-CoV-2(B.1.351)进行攻毒保护实验。HAdV5-S1-2A-HA免疫两周后,低剂量组(1×10^(8)vp/只)免疫小鼠后可检出HA特异体液免疫与S1特异的细胞免疫应答;而高剂量组(5×10^(9)vp/只)诱导小鼠产生了较强的双抗原(S1,HA)特异的体液和细胞免疫应答,并能完全保护小鼠对H3N2-X31攻击,降低SARS-CoV-2(B.1.351)感染后小鼠肺部病毒载量,延迟H1N1-PR8病毒感染后小鼠死亡发生。本研究制备的重组双价疫苗HAdV5-S1-2A-HA在小鼠体内诱导抗原特异的体液与细胞免疫应答。同时,它还可以在小鼠中诱导对SARS-CoV-2和H3N2感染的免疫保护,具有较好的研发与应用前景。

真核表达MERS-CoV刺突蛋白亚单位的信号肽序列优化研究

中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的刺突蛋白(Spike,S)亚单位1(S1)是引起宿主免疫反应和产生中和抗体的主要靶抗原,也是疫苗研发和病原检测的重要靶标,选用适宜的真核表达系统高效表达S1蛋白是进行相关研究的基础。为确定MERS-CoV S1在哺乳动物细胞中高效分泌性表达的信号肽序列,构建了含高斯荧光素酶(Gaussia luciferase,GLuc)、人组织纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator,tPA)及小鼠免疫球蛋白G的2a亚型(Mouse immunoglobular G subtype 2a,MIgG2a)7个信号肽(原始序列和改造序列)序列的MERS-CoV S1表达质粒,瞬时转染细胞后,通过Western Blot检测并比较细胞培养上清和裂解液中S1的表达水平及分泌表达效率(条带密度灰度扫描比),并对哺乳动物细胞表达的S1蛋白的纯度与抗原特性进行了分析。结果表明7种信号肽在293T、BHK21和ExpiCHO-S^(TM)三种细胞系统中介导MERS-CoV S1的高效分泌表达的效率各有不同,其中tPA-1信号肽介导S1抗原在ExpiCHO-S^(TM)中具有较高的分泌表达效率与产量,纯化的S1蛋白保持了较好的抗原性。本研究为进一步研发基于MERS-CoV S1的亚单位疫苗及免疫学检测试剂奠定了基础。

一种新的核酸自动化提取方法在病原体检测中应用的评价

目的评价一种新的核酸自动化提取方法在病原体检测中的应用。方法分别用试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)和核酸自动提取仪Genolution NX-48平行提取同一批104份临床咽拭子样本,利用商业化的RespiFinder SMART22多重荧光PCR检测试剂盒和甲型流感病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒,比较两种核酸提取方法对不同病原体检出率及甲型流感病毒最低检测限的影响。结果临床咽拭子样本经两种方法提取核酸后用于呼吸道多病原检测,结果具有高度一致性(Kappa> 0. 60)。可检出19种呼吸道病原,包括DNA病毒、RNA病毒及非病毒病原,其中检出率较高的病原为鼻病毒/肠道病毒(rhinovirus/enterovirus,Rhino/Entero)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、甲型流感(influenza A,InfA)病毒及腺病毒(adenovirus,Adeno)。QIAamp Viral RNA Mini Kit及核酸自动提取仪Genolution NX-48提取的甲型流感病毒的最低检测限为1. 36×10~0和1. 41×10~1 PFU/m L,差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论核酸自动提取仪Genolution NX-48应用性能良好,提取核酸省时、快捷、成本低,结合RespiFinder SMART22多重荧光PCR检测试剂盒,可进行临床和实验室大量样本的核酸快速提取及呼吸道多病原检测。