猪源Rab基因shRNA文库与稳定细胞株的构建及其对猪伪狂犬病病毒增殖的影响

【目的】探究Rab家族蛋白在猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞中的作用。【方法】以猪肾上皮细胞(PK15)为试验模型,构建Rab基因shRNA文库,并用嘌呤霉素筛选获得稳定的能够抑制猪源Rab基因表达的细胞株。用实时荧光定量PCR检测细胞敲减效率,通过流式细胞术检测敲减Rab基因对PRV增殖的影响;用Western blotting检测PRV-gB蛋白表达量,使用实时荧光定量PCR检测敲减Rab基因后PRV-gB、PRV-TK基因以及相关细胞炎性因子表达量。【结果】试验成功构建包含13种Rab基因敲减细胞系的shRNA文库。流式细胞术检测结果显示敲减Rab基因能显著抑制PRV-GFP增殖(P<0.05);病毒滴度与Western blotting检测结果表明,敲减Rab基因极显著抑制子代病毒的产生以及PRV-gB蛋白的表达(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示,敲减Rab基因会显著或极显著抑制PRV-gB、PRV-TK基因表达(P<0.05;P<0.01);敲减Rab14和Rab27基因后细胞中IFN-β、ISG15、IL-1β、IL-18基因表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。【结论】敲减Rab基因能够抑制PRV增殖。研究结果为进一步研究Rab基因在PRV生活周期中发挥的作用奠定基础。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示:成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,特异性强,所获抗体均识别p54蛋白C端127—146 aa肽段。本研究成功获得了ASFV p54蛋白和p54单克隆抗体,并鉴定了6株单克隆抗体的抗原表位,为p54蛋白功能研究和ASFV新型表位疫苗研究奠定了基础。

猪Lipin基因克隆及其组织分布的研究

采用逆转录PCR、电泳检测等方法，成功克隆得到了猪的Lipin1、Lipin2和Lipin3基因。这3个基因与小鼠的相应基因均具有较高的同源性，达83．2％～86．7％。组织分布结果显示：Lipin1广泛分布在猪的多种组织中，但Lipin2和Lipin3仅在肌肉、肺、回肠和睥中有分布。

农业大学《动物生物化学实验》教学的几点探索

文章针对新形势下大学实验课教育中出现的新问题,从明确目的,把握整体;做好预习,认真准备;严谨操作,紧抓细节;课后报告,完善总结等四个方面入手,通过实践摸索理论总结,形成了自己的一套关于实验课教学的观点和经验,调动了学生学习的积极性,通过教学结果来看,提升了教学效果。

一例鸡新城疫与大肠杆菌混合感染的诊断和预防

鸡新城疫主要危害鸡、火鸡和鸭、鹅等禽类，特别是肉仔鸡最易感。临床上常见的病型有：胚胎和幼雏死亡、气囊炎、腹膜炎、急性败血症、心包炎、脐炎、眼球炎、关节滑膜炎、出血性肠炎、输卯管炎等。目前临床上多见新城疫与大肠杆菌混合感染，给养殖业带来了巨大的经济损失．是养殖业最严重的疾病之一。

5.抗分泌因子的研究现状及展望

腹泻主要是胃肠中的离子和水的分泌异常引起的.肠道的离子与其它物质的交换是通过肠的神经系统来控制的,肠的神经接受部分包括化学感应器、结构感应器和温度感应器,分别能感应化学物质、结构变化和温度变化.……

不同提取方法对决明子蒽醌类成分及抗氧化活性的影响

采用回流、索氏、微波及超声4种提取方法,测定4种决明子提取液中的游离蒽醌和总蒽醌的含量;采用DPPH、FRAP两种方法测定其抗氧化活性,并分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。结果表明:在对游离蒽醌的测定中以索氏提取法最高(0.16%),与其他提取方法相比差异显著(P<0.05);在对总蒽醌的测定中,提取率为超声(0.63%)>微波(0.56%)>回流(0.49%)>索氏(0.47%);抗氧化活性测定发现,以回流液的抗氧化能力最强,其次是微波液,二者与超声液和索氏液相比有显著性差异(P<0.05);游离蒽醌的含量与抗氧化活性呈极显著负相关(P<0.01)。

荷斯坦奶牛初乳中酶及激素的含量变化研究

在荷斯坦奶牛分娩后1～8 d采集当天乳样,分析了乳中部分酶的活力和激素的含量变化。结果表明,碱性磷酸酶的活力在1 d中最高,达到5.39 U(P<0.05),而后随着时间延长酶的活力下降;-γ谷氨酰转肽酶在1 d达到1002.08 U(P<0.05),而后活力开始下降,7 d达到602.76 U;黄嘌呤氧化酶和乳酸脱氢酶的活力分别在40～120 U和20～40 U之间变化,各天之间无显著性差异(P>0.05);瘦素的质量浓度在2.30～5.14 ng/mL之间变化,各天之间无显著差异(P>0.05);胰岛素的含量1 d为最高2043.40 u IU/mL(P<0.05),随时间呈逐渐下降趋势;皮质醇的质量浓度1 d最高为95.77 ng/mL(P<0.05),总体呈下降趋势;泌乳素的质量浓度1 d为9.06 ng/mL,而后逐渐下降,各天之间无显著差异(P>0.05)。

高效液相色谱法检测奶牛初乳中18种氨基酸

应用高效液相色谱法对奶牛分娩后1～3d初乳中18种氨基酸的含量变化进行了分析。结果表明：初乳中各种氨基酸的含量均随泌乳时间的延长而下降，谷氨酸的含量在第1天达到最高，而蛋氨酸的含量是初乳氨基酸中最低的。

地塞米松对小鼠脂肪组织中孤啡肽及其受体基因表达的影响研究

目的:探讨地塞米松对孤啡肽及其受体mRNA在小鼠附睾脂肪组织中表达的变化。方法:将12只雄性昆明小鼠,随机分为正常组和地塞米松组,分别采集其脂肪组织,用RT-PCR方法检测孤啡肽及其受体mRNA水平的变化。结果:与正常组相比,地塞米松组孤啡肽及其受体的mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。结论:地塞米松可能抑制孤啡肽及其受体基因的活性和合成,对孤啡肽及其受体基因的表达可能具有强烈的下调作用。

高效液相色谱法检测乳品中谷氨酰胺的研究

试验建立了高效液相色谱法检测乳制品中谷氨酰胺的方法。通过谷氨酰胺与双(1,1-三氟乙酸基)碘苯(BTI)反应后酸水解,再用异硫氰酸苯酯衍生后,用HPLC检测不同乳制品中谷氨酰胺的含量。结果显示,纯牛奶中的谷氨酰胺含量最高。

妊娠和泌乳期大鼠血清激素水平的变化

[目的]探讨大鼠血清糖代谢激素与生殖激素的关系及其与生殖周期活动的相关性。[方法]以妊娠中晚期和泌乳早中期的24只雌性处女SD大鼠和12只雄性SD大鼠为研究对象,用放射免疫法测定大鼠血清FSH、LH、胰岛素和胰岛素抗体的水平。[结果]FSH从妊娠中期到泌乳早期呈现先下降,再升高,后下降的趋势,泌乳中期降至最低,差异不显著;LH从妊娠中期到泌乳早期变化不大,从泌乳早期到泌乳中期有所上升,且差异显著;胰岛素和胰岛素抗体结合率从妊娠中期到妊娠晚期呈上升趋势,从妊娠晚期到泌乳早期急剧下降,泌乳早期降至最低,至泌乳中期迅速升至妊娠中晚期水平。[结论]大鼠血清胰岛素及其抗体与LH在妊娠和泌乳期的变化一致,与FSH的变化相反。

泌乳晚期大鼠乳腺生长抑素基因的表达

利用大鼠生长抑素基因设计引物,对泌乳晚期SD大鼠的乳腺组织生长抑素基因进行RT-PCR检测,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序。结果发现在泌乳晚期大鼠乳腺中有生长抑素基因的表达。

预乳化在牛乳中添加DHA的工艺研究

DHA作为多元不饱和脂肪酸系列中重要的一种,现已发现其对人类的许多疾病的治疗和预防有着重要的意义。但是由于DHA常温下易于氧化,目前在牛乳中添加DHA所采用的方法和工艺,不仅设备和原料价格昂贵,而且生产工艺要求高,给生产带来了极大的风险,同时也加大了生产成本。试验就是否可以通过预乳化这一简单的工艺将普通的DHA添加到牛乳中进行了研究。

为学生开启生命科学的大门——浅谈动物生物化学绪论教学

根据教学经验和体会,提出了关于动物生物化学绪论课教学方法的几点思考,举例说明了在绪论教学中关于课程内容、发展历史和前景的教学方法和体会。

青年教师如何上好一堂生物化学课

本文从课前准备,课堂教学和课后辅导这三方面出发,并结合多年的教学实践,探讨了青年教师和初次上课的教师如何才能上好生物化学课,希望对青年教师在授课中能有所启发和帮助。

猪MC4R基因突变体真核表达载体的构建及功能研究

为研究MC4R基因不同突变体的功能差异,本研究从猪肌肉组织中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pcDNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体MC4R1,将载体转染BHK细胞后Western blotting检测蛋白表达。通过点突变法得到MC4R基因在707/892位点的3个突变载体,将突变载体瞬时转染到BHK细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞检测荧光表达,结果发现,克隆的MC4R1基因序列长度大约1 000bp,在707/892位点序列为G/G,将构建的真核表达载体MC4R1转染BHK细胞,经过Western blotting检测发现MC4R1蛋白正常表达;通过点突变法得到在707/892位点突变的突变载体MC4R2(G/A)、MC4R3(A/G)、MC4R4(A/A),经过激光共聚焦观察荧光表达后发现,突变受体在细胞膜上均有正常表达,流式检测发现4个突变受体表达的荧光平均强度并没有显著差异(P>0.05)。通过构建MC4R基因突变载体后发现,707/892位点突变对于MC4R受体在细胞膜的表达没有显著影响,其具体机制作用还需深入研究。

禁食对小鼠孤啡肽及其受体基因在脂肪组织中表达的影响

探讨禁食状态下孤啡肽及其受体mRNA在脂肪组织中表达的变化。将18只雄性昆明小鼠随机分为正常组、禁食组、再喂食组,采集其脂肪组织,用RT-PCR方法检测孤啡肽及其受体mRNA水平的变化。结果表明,孤啡肽及其受体基因均在小鼠脂肪组织中有表达,与正常组相比,禁食组孤啡肽及其受体的mRNA表达水平明显上调(P<0.05),而再喂食组表达差异不显著。说明在禁食情况下,孤啡肽及其受体基因对脂肪组织起到一定的调节作用。

普通高等农林院校生物化学学习兴趣培养的实践与探索

生物化学是农林院校畜牧兽医等专业的主要基础课。从任课教师课前准备、课堂上及课外三个环节入手,探讨如何激发和培养学生学习生物化学的兴趣,以及如何进一步调动学生的内在能动性,提高和保持学生的学习兴趣,对如何克服学生学习生物化学课程的畏难心理提出了建议。

气相色谱法检测牛乳中共轭亚油酸的研究

共轭亚油酸(CLA)主要存在于反刍动物乳制品中,本试验建立了气相色谱法检测CLA的方法,采集牛乳提取脂肪检测脂肪酸中CLA的含量,发现在试验条件下c9,t11-CLA占到总脂肪酸含量的1.25%,是CLA异构体的主要形式。