成骨不全及其分子机制

成骨不全作为罕见性遗传性结缔组织疾病,具有临床异质性与遗传异质性,迄今已经分为15个亚型.有常染色体显性遗传与常染色体隐性遗传两种遗传方式.常染色体显性遗传以Ⅰ型胶原蛋白结构基因COL1A1、COL1A2突变为主.非Ⅰ型胶原蛋白突变的常染色体隐性遗传的成骨不全患者数量少,但致病基因种类多,涉及到胶原合成后异常修饰,胶原蛋白分子伴侣及羧基端前肽剪切酶缺陷、成骨细胞与破骨细胞分化及转录因子异常、钙离子通道与Wnt信号通路分子等诸多方面.致病基因及其机制的研究,对于成骨不全的基因确诊及个体化药物治疗意义重大.

寡核苷酸芯片制备及其杂交条件的优化

探讨了2种不同硅烷化试剂3-氨基丙基三甲氧基硅烷、三甲氧基丙基二乙烯基三胺及其不同处理时间对寡核苷酸探针固定效率的影响.结果表明3％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液处理2h,然后用5％戊二醛溶液处理1 h,可以获得很好的杂交信号.对比polyT15空间子,含有相同寡核苷酸序列的PEG6、PEG12空间子能使杂交信号增强6、8倍.在以pH值9-11的碳酸盐缓冲液为点样液时,杂交信号随着pH值的逐渐升高而略有下降.寡核苷酸探针的浓度和荧光标记样品的浓度影响杂交结果,当寡核苷酸探针的浓度为25μmol、所用长度为110bp的荧光标记的PCR产物为2μL,经杂交液6×SSEPT稀释至10μL时,可以获得很好的杂交信号.

乙肝病毒突变位点的寡核苷酸与肽核酸阵列杂交检测

目的:比较利用寡核苷酸阵列和肽核酸阵列检测乙肝病毒突变位点。方法:针对乙肝病毒常见的1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1896G-A 3个突变位点,设计寡脱氧核苷酸和肽核酸检测探针,探针经固定后分别与不对称PCR荧光标记的靶DNA杂交,扫描分析荧光信号强度,DNA序列分析3位点的变异情况。结果:对于寡核苷酸芯片,1762与1764联合位点、1858以及1896位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为1.44、1/1.24、1.05。对于肽核酸芯片,相应位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为2.8、1/3.02、1.71。DNA序列分析结果表明该样本中1858位点为突变位点,1896以及1762与1764联合位点不存在突变。结论:与寡脱氧核苷酸探针相比,肽核酸与靶DNA杂交结合能力和识别单碱基错配能力均高于相应的寡脱氧核苷酸,二者杂交结果与测序结果一致。

兴安天门冬的染色体研究

首次对兴安天门冬（ＡｓｐａｒａｇｕｓｄａｕｒｉｃｕｓＦｉｓｈ．ｅｘＬｉｎｋ．）进行了染色体数目和核型研究．结果表明：染色体数目为２ｎ＝１８，核型公式为Ｋ（２ｎ）＝１８＝１０ｓｍ＋８ｍ，核型为“２Ａ”型．

Dicer基因

Dicer编码RNaseⅢ家族,是一进化保守基因。它包含四个ORF框架:DExH/DEAH盒解旋酶、PAZ、两个RNaseⅢ催化区与双链RNA结合区DS-RBD。目前发现Dicer在RNA干扰以及异时发育中起重要作用,它可以切割长的双链RNA成长度为22nt左右的小干扰RNA-siRNA,异时基因stRNA的成熟也与需要Dicer的参与。Dicer行使切割功能需要RDE-1或其同源基因ALG1/ALG2的协同。随着研究的深入,Dicer的其它生物功能将进一步被发现。

DNA微阵列基片的化学处理

对于合成后点样的DNA微阵列 ,基片的表面化学处理非常重要。它直接影响到样品与基片的结合效率 ,进而影响杂交结果。基片表面的各种化学修饰方法多种多样 ,物理吸附主要以赖氨酸包被为主。共价结合通常使用同源偶联分子或异源偶联分子 ,还可以在基片表面组装线状、分支状连接分子或包被琼脂糖。着重介绍了DNA微阵列的制备 ,即样品如何固定到玻璃基片上。总结了不同类型基片表面的化学修饰方法以及DNA与基片的化学结合。

肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)阵列

肽核酸(PNA)以N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代DNA分子中的磷酸戊糖骨架。它能特异性地识别与DNA、RNA所形成的杂交体。PNA-DNA、PNA-RNA的热稳定性要比相应的DNA-DNA、DNA-RNA高,而且PNA识别单碱基的能力强于DNA和RNA,使之在微阵列,尤其是SNP检测领域有着广泛的应用前景。本文简述了PNA阵列从探针设计、阵列合成、杂交和检测的全过程。

利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒

目的:利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒。方法:根据序列Blast比对分析结果,设计逆转录不对称PCR扩增引物和寡核苷酸检测探针。采用Trizol试剂从人静脉血中提取总RNA,经过逆转录和不对称PCR扩增得到的PCR产物与排列有寡核苷酸探针的芯片杂交,杂交后的芯片经激光共聚焦扫描分析。结果:SARS阳性样品与寡核苷酸芯片杂交后出现阳性杂交信号,具有不同二级结构的寡核苷酸探针杂交信号强度不一。结论:寡核苷酸芯片适于快速准确、平行大量地检测SARS病毒。

肠道微生物与骨病的研究进展

人体肠道微生物菌群基因数量超过人体基因数量的100倍,被称为"人体第二基因库",这些基因赋予各种细菌不同的功能,产生极其复杂多样的代谢产物,对于调节人体消化、免疫、内分泌、乃至神经系统等功能具有重要作用。而处于稳态的肠道微生物不但能依附于肠黏膜表面形成保护屏障,阻止致病菌的生长、繁殖和入侵,还能通过黏膜系统促进免疫系统成熟,有助于机体有效抵抗病原微生物的感染。如果肠道菌群平衡被打破,那么宿主患各种疾病的风险就会随之升高。宿主健康与否会导致肠道微生物发生变化,进而通过间接刺激或抑制成骨细胞和激活破骨细胞而打破骨矿化平衡,影响骨健康。除此之外,它们还可以通过维持免疫系统稳态参与调控骨代谢,通过影响生长因子调节、营养物质吸收和宿主代谢通路等参与骨质疏松症、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等相关骨病的发生。目前关于肠道微生物菌群与骨病的研究较少,且多集中于菌群差异性对骨病的影响,而肠道菌群影响骨病的分子机制亟待进一步研究。本文就近年来国内外对肠道微生物与骨病关系的研究进展进行综述。

成骨不全环状RNA生物信息学分析

目的对成骨不全血清中差异表达的miR-21、miR-26a、miR-29a、miR-29b、miR-30e、miR-34c、miR-133a、miR-145、miR-210、miR-489与miR-1297等共11种miRNAs进行circRNAs及其靶基因的预测,同时分析其与circRNAs及靶基因间的相互作用。方法采用starbase软件对11种差异性表达miRNAs相关circRNAs进行预测,将得到的miRNA-circRNA进行频数分布分析并通过cytoscape软件进行网络分析寻找核心分子。采用miRWALK软件对11种差异性表达miRNAs相关靶基因进行预测,将得到的miRWALK-靶基因进行频数分布分析并通过cytoscape,DAVID软件进行网络分析寻找核心分子。结果 Starbase软件对11种不同miRNAs所预测的靶circRNAs的总数量为222个,非重叠circRNAs为141个。其中MIB1_hsa_circ_000886,MIB1_hsa_circ_002013,CPNE1_hsa_circ_000657,CYP4F3_hsa_circ_001395,KIAA1586_hsa_circ_001439与其中4种miRNA相互作用。另有14个circRNAs与3种miRNA相互作用。miRWALK软件对11种不同miRNAs所预测的靶基因中CNOT6、ELF2、NAV3等基因在不同数量级数据库中与相应不同种miRNAs作用密切。通过对11种miRNA相应circRNA以及靶基因生物学预测分析得到YES1基因与miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713与LMNB2_hsa_circ_001499之间存在相互作用。PPP2CA与miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之间存在相互作用。NTN4和SRGAP1与miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之间存在相互作用。结论本研究对成骨不全血清中差异表达的11种miRNAs及其相互作用的circRNAs、靶基因与相关信号通路进行了网络分析与预测,为进一步分析之间相互作用奠定了基础。

实时定量PCR检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变及其与临床指标的相关性

目的采用实时定量PCR检测接受与未接受拉米夫定治疗的乙肝患者血清中乙肝病毒(HBV)突变情况,并将检测结果与临床指标进行相关性分析。方法采用touch-down PCR反应程序,并结合SYBR Green Ⅰ染料进行实时定量PCR,检测115份乙肝患者血清标本(其中50名患者未服用过拉米夫定,65名患者服用过拉米夫定)。随机选择115份标本中的30份用同样的方法提取血清DNA,进行PCR扩增及测序,并与实时定量PCR检测结果进行比较。将乙肝病毒YMDD突变实时定量PCR检测结果与临床各指标之间进行相关性分析。结果115份血清标本中,75份含有野生型HBV(其中49份来自未接受过拉米夫定治疗的患者),40份含有YMDD突变的HBV(其中1份来自未接受过拉米夫定治疗的患者);180位点的突变检测中,98份标本含有野生型HBV,17份标本含有突变型HBV。随机选取的30份标本测序结果与实时定量PCR检测结果完全一致。乙肝病毒拉米夫定耐药突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间无相关性,而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性,用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180和204位点突变具有相关性。结论实时定量PCR可以高效、准确地检测拉米夫定治疗后乙肝病毒的耐药突变。

成骨不全的分子机制

成骨不全是一类临床表现为骨质脆弱、易骨折等特征的罕见遗传性疾病.绝大多数(90%以上)显性患者发病系由Ⅰ型前胶原α链COL1A1和COL1A2基因突变引起胶原合成量不足,或结构改变.少数隐性患者发病为其他相关基因突变导致胶原翻译后过度修饰、折叠、装配和分泌过程异常.本文就成骨不全发病的遗传学及分子生物学机制作一综述.

MoMLVgag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定

目的:构建含MoMLVgag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法:应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明,gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kDa)为194.78×103。然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果:酶切鉴定的片段大小分别为5.2kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kDa)为194.78×103,与预期相符。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒。结论:构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。

内质网应激与骨细胞及相关骨病的研究进展

内质网(endoplasmic reticulum,ER)作为细胞内重要的膜性结构,负责分泌蛋白与膜蛋白的折叠加工,脂类的生物合成以及钙平衡的调节。当ER环境发生改变,如缺血、缺氧、突变蛋白的大量堆积时,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)启动,并引发未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和固醇调节级联反应。在应激状态下,ER对维持细胞内稳态起到至关重要的作用。一方面ERS有助于成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的生长,可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化,并抑制细胞凋亡的发生。另一方面在高强度长时间应激状态下,ERS无法维持细胞稳态,会通过多种信号通路诱导细胞凋亡的发生,加速细胞更新。根据近几年已有报道的文献研究整理,在骨质疏松、成骨不全、氟骨症等相关骨病的研究中,ERS同样发挥着重要的调节作用。特别是在发病早期,ERS通过对多种骨细胞的调节,缓解病情。当病情严重ERS会触发内质网凋亡信号,导致细胞凋亡和生物体的损伤。本文就近年来国内外对ERS与骨细胞及相关骨病的研究进展进行综述。

疱疹病毒编码的miRNAs的研究进展

MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22个核苷酸的RNA,在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性。目前,通过生物信息学手段和分子克隆方法,已发现了3518种miRNAs,在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。最近研究发现某些病毒基因组也能够编码miRNAs,其中大部分为疱疹病毒,这些miRNAs在调控病毒自身表达以及病毒与宿主相互作用方面可能起到重要的作用。找出病毒可能编码的miRNAs,探索其对病毒感染、复制、表达的作用,有助于病毒分子生物学的研究,也会为研发防治病毒的新方法和新途径提供新的思路。

肽核酸芯片技术初探

目的 研究解决以DNA为探针的寡核苷酸芯片特异性、重复性差等问题。方法 用肽核酸 (PNA)探针制备PNA芯片 ,以荧光标记的寡核苷酸 (ODN)及HBVDNA的PCR产物为检测对象 ,探讨PNA芯片的杂交条件。用PNA芯片检测HBVDNA及单碱基突变 ,并与DNA芯片做一对比。结果 PNA探针对单碱基突变的识别力比相应的DNA探针更强 ;用其检测HBVDNA ,得到了与常规PCR试剂盒一致的检测结果。结论 PNA探针独特的结构决定了它在杂交中具有与靶DNA结合的稳定性高及特异性强等优点。

山东鲁山苔藓植物的研究

本文首次报道了鲁山苔藓植物９３种，隶属于２２科和５４属。其中藓类植物１７科、４８属、８５种；苔类植物５科、６属、８种。本文在分类的基础上，对鲁山苔藓植物的生态类群及分布做了初步分析探讨，并同山东境内的泰山、崂山、沂山进行了比较。最后附有苔藓植物名录。

寡核苷酸芯片杂交技术对HBV DNA分型的研究

目的 建立单碱基延伸 (SBE)标记靶序列的方法 ,解决目前寡核苷酸芯片存在的空间障碍、特异性差、重复性差等问题。方法 利用不同的方法标记靶序列或把已标记好的长片段靶序列片段化后 ,与寡核苷酸芯片进行杂交分析。结果 用两种方法检测HBVDNA及分型 ,得到了相同的结果。结论 以单碱基延伸 (SBE)标记靶序列的方法重复性好 。

国外罕见病药物政策发展现状对比分析

对国外罕见病药物政策发展现状进行分析。描述了各国的罕见病药物政策发展现状。通过对比发现差异并总结罕见病药物制度的实施对罕见病领域的研究和人类健康事业发展产生的影响,也为各国罕见病的政策制定及公共卫生事业发展提供参考。