考察不同因素对茯苓佐剂多糖提取的影响

目的考察提取温度、料液比、提取时间、提取次数、药材粒径及搅拌方式等因素对茯苓粗多糖及其疫苗佐剂多糖的影响。方法提取温度选择20~100℃;料液比选择1∶5~1∶20;提取时间选择1~6 h;提取次数选择1~3次;药材粒径选择原饮片50目;选择静止和搅拌模式。采用苯酚-硫酸法测定糖含量,高效液相-凝胶过滤法测定多糖相对分子质量,PMP衍生-毛细管电泳法测定单糖组成。结果 (1)控制提取温度应<70℃;(2)料液比在1∶7.5~1∶15之间;(3)提取时间可为2 h;(4)提取次数不超过2次;(5)原饮片需要粉碎提取,可为20目;(6)搅拌有利于活性多糖的溶出。结论提取温度、提取次数和搅拌方式对茯苓多糖影响明显,药材粉碎有利于佐剂多糖浸出。

盐酸石蒜碱通过Akt/Smad通路抑制肝星状细胞增殖与活化

目的探索并验证盐酸石蒜碱(LH)抗肝纤维化活性,并初步阐明其机制,为LH研发成为抗肝纤维化药物提供理论支持。方法利用I型胶原α1(COL1A1)启动子-荧光素酶报告系统筛选LH抗肝纤维化活性,利用SRB方法检测LH对人肝星状细胞LX2增殖的影响。通过TGF-β1诱导LX2细胞活化建立体外肝纤维化模型,运用q RT-PCR和Western blot方法检测不同浓度LH对肝纤维化标志基因转录水平以及蛋白表达水平的抑制作用。Western blot方法检测肝纤维化相关信号通路的蛋白表达变化。结果 LH可剂量依赖性地抑制COL1A1基因启动子活性,提示其可能有抗肝纤维化活性。LH显著抑制肝星状细胞LX2的增殖,其对LX2细胞的IC_(50)值为(9.79±1.02)μmol/L;LH可以抑制活化的LX2细胞肝纤维化相关基因的mRNA和蛋白的水平;LH可以抑制Akt/Smad信号通路的活性。结论 LH可能通过Akt/Smad信号通路抑制肝星状细胞增殖与活化,从而发挥抗肝纤维化的作用。

芍药二酮抗肝纤维化及抗炎的活性和机制研究

本文旨在研究芍药二酮(palbinone,PB)的抗肝纤维化活性和抗炎活性,并初步探讨内在的调节机制,为其发展成为抗非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)候选药物奠定活性基础。首先采用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)方法检测化合物PB对人肝星状细胞LX-2和大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响。并在转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)诱导的体外肝纤维化细胞模型中,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot的方法检测不同浓度芍药二酮对肝纤维化标志基因转录水平及蛋白表达水平的抑制作用,同时分析芍药二酮调控肝纤维化相关基因的作用机制。另外,在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合尼日利亚菌素(nigericin)诱导的炎症细胞模型中,采用ELISA的方法检测芍药二酮对于细胞释放白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平的影响,同时Western blot检测芍药二酮对炎症信号通路中相关蛋白表达的影响。结果表明,芍药二酮可以显著性抑制肝星状细胞LX-2和HSC-T6的增殖活力,其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))值分别为(375.11±55.45)和(260.27±36.81)nmol·L^(-1),并且芍药二酮对TGF-β1诱导的肝纤维化相关基因Ⅰ型胶原α1(collagen typeⅠα1,COL1A1)、TGF-β1、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)的表达水平呈现出剂量依赖性的抑制作用。机制研究表明,芍药二酮可能是通过抑制了Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)的表达水平,从而减弱了其对于下游纤维化通路的激活作用。此外,芍药二酮还可以通过抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路的活性,减少炎症因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)和IL-1β的释放,从而发挥抗炎作用。综上所述,芍药二酮不仅能够通过抑制YAP蛋白的表达抑制肝星状细胞的增殖与活化,而且能够同时抑制炎症因子的表达与释放,其对于肝纤维化和炎症的双向调节作用为芍药二酮开发为抗非酒精性脂肪性肝炎药物提供理论支持。

Pepstatin Pr通过YAP-TGFβ-Smad通路发挥体外抗肝纤维化作用

肝纤维化是各种慢性因素引起的肝脏损伤后组织修复代偿反应,其进一步恶化会导致肝硬化、肝功能衰竭甚至是肝细胞癌。肝星状细胞的异常活化是肝纤维化发生发展的细胞学基础。化合物pepstatin Pr是从链霉菌CPCC 202950中分离得到的pepstatin A衍生物。本实验目的在于研究pepstatin Pr的抗肝纤维化活性并探索其分子机制。通过给予TGFβ1诱导人肝星状细胞LX-2活化并进行不同浓度的pepstatin Pr处理后,应用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B, SRB)比色法检测pepstatin Pr对LX-2细胞的细胞毒性,应用real time PCR和Western blot方法检测pepstatin Pr对COL1A1、α-SMA、组织蛋白酶D (cathepsin D)、TGFβ、Smad以及YAP/TAZ蛋白表达与磷酸化水平的影响。结果显示pepstatin Pr对LX-2细胞无明显细胞毒性,并且可显著降低肝纤维化标志物COL1A1及α-SMA的mRNA和蛋白表达,同时在蛋白水平上抑制cathepsin D、TGFβ1、YAP和TAZ的表达, Smad2的磷酸化水平,以及YAP核转位。综上, pepstatin Pr可通过调控YAP-TGFβ-Smad通路抑制由TGFβ1诱导的肝星状细胞活化,具有良好的体外抗肝纤维化活性。