利用mCherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子体外活性质粒的构建及应用

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌感染引起的人畜共患传染病,对养殖业的发展和人类的公共健康安全有着严重的危害。由VirB编码的Ⅳ型分泌系统(T4SS)为布鲁氏菌重要的毒力因子,布鲁氏菌侵染细胞后,吞噬体酸化被证实是VirB启动T4SS的主要信号,利用m Cherry红色荧光蛋白作为报告基因,构建可以在体外酸性环境中检测VirB启动子活性的质粒,对于研究布鲁氏菌毒力基因的表达具有重要意义。以pBE-1质粒为骨架,构建质粒pBE-1-VirB-m Cherry,以pBE-1-ptrc-m Cherry质粒为阳性对照,通过电穿孔法转入布鲁氏菌S2株中,构建工程菌株S2(pBE-1-ptrc-m Cherry)和S2(pBE-1-VirB-m Cherry)。体外酸性环境下诱导工程菌株S2(p BE-1-VirB-m Cherry),结果显示,m Cherry荧光蛋白可以精准地报告VirB启动子的活性。结果表明,构建了利用m Cherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子活性的质粒,并验证m Cherry荧光蛋白可以精准反应布鲁氏菌VirB启动子在体外的活性,为研究布鲁氏菌毒力基因,揭示其Ⅳ型分泌系统致病机制奠定基础。

牛结核分枝杆菌ESAT6-CFP10-BFH融合蛋白原核表达及皮试反应

为了改善ESAT6-CFP10融合蛋白检测牛结核分枝杆菌感染存在灵敏度低的问题,应用铁蛋白骨架显著性提升EC(ESAT6-CFP10)法的灵敏度,将ESAT6、CFP10和牛源铁蛋白重链(BFH)用柔性多肽连接,按照ESAT6-CFP10-BFH的串联组合方案设计基因序列,构建pET-28a-EC-BFH重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。使用自诱导培养基对铁蛋白EC融合抗原(EC-BFH蛋白)进行诱导表达,亲和层析镍柱法纯化EC-BFH蛋白,使用蛋白印迹(Western blot)对EC-BFH蛋白进行鉴定及纯度测定。将EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试,通过观察皮试部位是否会引起炎性反应,验证EC-BFH蛋白的特异性。对牛结核分枝杆菌致敏成功的豚鼠,以提纯牛型结核菌素(PPDB)作为对照,检测EC蛋白和EC-BFH蛋白效价对比阳性率。结果表明:EC-BFH蛋白的相对分子质量约为48.4 kDa,与预期相同,说明成功纯化EC-BFH蛋白。EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试24 h后无炎症反应,说明EC-BFH蛋白特异性良好。根据阳性率数据显示EC-BFH蛋白效价远远高于EC蛋白;在注射量为1,10和20μg时,EC-BFH蛋白皮试的阳性率均高于EC蛋白,尤其注射量在1μg时,EC蛋白和EC-BFH蛋白的阳性率分别为16.6%和100%,且EC-BFH蛋白与PPDB的阳性率接近。结果表明EC-BFH融合蛋白提高了EC法检测牛结核分枝杆菌感染的灵敏度,增强了皮试反应效果,作为检测牛结核分枝杆菌感染的诊断试剂有很大的研究价值。