脂噬在动脉粥样硬化中的作用及中医药干预研究进展

动脉粥样硬化(As)是一种多因素共同作用的慢性炎症性血管病变。脂质蓄积是As发生的关键病理因素之一,其通过触发血管内炎症细胞浸润、内皮细胞损伤、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞增殖及迁移等多个病理环节,最终导致As斑块形成。脂噬作为一种选择性的自噬进程,通过溶酶体介导选择性降解细胞内储存中性脂质的细胞器脂滴,减少脂质沉积,从而维持细胞稳态,成为As研究的新靶点。本文对细胞脂噬功能在As中的作用的研究进展及相关中医药治疗进行讨论,旨在从脂噬角度为中医药防治As提供可行性思路。

瓜蒌-薤白对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化过程中NLRP3炎症小体活化的影响

目的通过建立ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(As)模型,探讨As病程不同时间点NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)炎症小体表达水平的变化及瓜蒌-薤白的干预作用。方法将高脂饲养6、20、34周的ApoE^(-/-)小鼠均随机分为模型组(M1、M2、M3)和给药组[6 g/(kg·d)](GX1、GX2、GX3),每组10只;另设C57BL/6J小鼠为空白组(C1、C2、C3)。空白组及模型组小鼠给予生理盐水灌胃,给药组小鼠每日给予相应药物灌胃,共4周。实验结束后处死小鼠,油红O染色评估主动脉斑块面积及形态;HE染色观察主动脉病理形态学变化;免疫组织化学法检测主动脉NLRP3表达;ELISA法检测血清中白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)水平;Western blot法检测主动脉组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)的蛋白表达;qRT-PCR检测主动脉组织中NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达。结果在As病程进展过程中,模型组小鼠主动脉脂质累积和斑块面积显著增加,血清中IL-1β和IL-18的表达不断升高,NLRP3和ASC的蛋白及mRNA的表达均不断上调。Caspase-1的蛋白表达也呈上升趋势,但M2与M3组间的比较无统计学差异。与模型组相比,给药组各时间点小鼠主动脉的脂质累积和斑块面积显著减少,血清中IL-1β和IL-18的水平降低;主动脉组织中N LRP3、ASC、Caspase-1蛋白和mRNA表达显著下调。结论NLRP3炎症小体参与了主动脉As的病变过程,瓜蒌-薤白可能通过调节As模型小鼠主动脉不同阶段NLRP3炎症小体的表达,从而发挥抗As的作用。

“瓜蒌-薤白”药对诱导自噬抑制NLRP3炎症小体激活减轻RAW264.7巨噬细胞炎症反应

考察“瓜蒌-薤白”药对(GX)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)损伤的RAW264.7巨噬细胞NLRP3炎症小体活化、炎症因子释放及自噬水平的影响,探究GX减轻巨噬细胞炎症反应的自噬机制。通过体外建立LPS诱导RAW264.7巨噬细胞损伤模型;采用CCK-8法检测巨噬细胞存活率;Western blot法检测巨噬细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermoprotein domain 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cystein-asparate protease-1,caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、酶联相关轻链蛋白3Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)、选择性自噬接头蛋白p62/sequestosome 1(selective autophagy junction protein p-62/sequestosome 1,p62)蛋白表达;ELISA法检测巨噬细胞分泌炎症因子IL-18及IL-1β的水平;透射电镜观察巨噬细胞中自噬小体数量;免疫荧光法检测巨噬细胞中LC3Ⅱ、p62的表达水平。结果显示,GX可显著降低巨噬细胞中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达;GX明显增加巨噬细胞中LC3Ⅱ表达,减少p62表达;GX显著减少巨噬细胞中炎症因子IL-18、IL-1β分泌;GX显著提高巨噬细胞中自噬小体数量;GX明显增加LC3Ⅱ的免疫荧光强度,降低p62的免疫荧光强度。加入3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)自噬抑制剂后可逆转GX抑制NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达,减少炎症因子IL-18、IL-1β释放的作用。以上结果表明,GX可能通过上调细胞自噬水平,抑制NLRP3炎症小体活化,从而减少炎症因子释放抑制巨噬细胞炎症反应。

基于网络药理学和实验验证探究经典药对“瓜蒌-薤白”治疗痰瘀互结心血管疾病的作用机制

“瓜蒌-薤白”药对(GX)应用历史悠久,为历代医家长期遣方用药的经验总结,但其治疗痰瘀互结心血管疾病的作用机制尚未完全阐明。本研究采用网络药理学分析与动物实验验证相整合的研究策略,探究经典药对GX治疗痰瘀互结心血管疾病的分子作用机制。动物实验过程均遵循安徽中医药大学实验动物伦理委员会的规定(批准号:AHUCM-rats-2021070)。基于前期HPLC-Q-TOF-MS分析结合数据库,获取69个GX药对的化学成分及163个GX治疗痰瘀互结心血管疾病的靶点,筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (Akt1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素6(IL6)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、细胞肿瘤抗原p53 (Tp53)等关键靶点,富集分析表明GX治疗痰瘀互结心血管疾病的靶点主要参与PI3K/Akt信号通路、鞘脂代谢、血小板激活、缺氧诱导因子-1 (HIF-1)、ras相关蛋白1 (rap1)等信号通路,分子对接分析显示芹菜素、葫芦素D、亚麻酸、山柰酚等6个关键化学成分与Akt1、TNF、IL6、VEGFA和Tp53均具有潜在的结合能力。在动物实验验证中,与痰瘀互结证大鼠模型相比, GX能显著降低模型大鼠的痰瘀互结证候积分,改善血液流变学、血脂及血管内皮结构紊乱,显著降低血清内皮素-1 (ET-1)水平,升高血清一氧化氮(NO)和一氧化氮合成酶(eNOS)水平,恢复主动脉血管内皮功能;并能显著减少主动脉中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1)表达,改善主动脉血管内皮损伤;Western blot实验显示GX显著降低主动脉磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及Akt蛋白磷酸化水平。本研究揭示了GX治疗痰瘀互结心血管疾病的多成分、多靶点、多通路的作用特征,并阐明GX逆转痰瘀互结大鼠模型病理变化,改善血管内皮功能及炎性损伤,可能与其抑制PI3K/Akt信号通路有关。