昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前不同培养方法的效果比较

目的:胚胎干细胞的获得、克隆与传代对实验条件及操作技术水平要求较高。分别将单纯胚胎干细胞培养液法与KSOM-胚胎干细胞培养液法应用于昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前阶段,对体外培养的胚胎干细胞进行鉴定,并比较其增殖与克隆形成情况。方法:实验于2006-03/10在哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室暨组织工程中心完成。①冲胚液配制:含体积分数为0.05胎牛血清的磷酸盐缓冲液,4℃冰箱保存。②KSOM胚培养液配制:将配制好的贮存液放入-20℃冰箱保存,用时加入1g/L的胎牛血清白蛋白和1mL/L的丙酮酸钠,过滤,调配至100mL。③取6～8周龄雌性昆明小鼠35只腹腔内注射孕马血清绒毛膜促性腺激素7.5IU/只,48h后注射人绒毛膜促性腺激素7.5IU/只,然后与10周龄雄性昆明小鼠15只合笼,次日晨雌鼠见栓者记为妊娠0.5d。④于妊娠3.5d冲胚,将冲出的囊胚分别应用于单纯胚胎干细胞培养系统、KSOM-胚胎干细胞培养系统。前者直接利用胚胎干细胞培养液在饲养层上培养并孵出囊胚;后者先应用KSOM液滴培养囊胚至孵出,再改用胚胎干细胞培养液于饲养层上培养孵出的囊胚。⑤将孵出的囊胚置于预先制备好的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养,酶-机械法分离囊胚内细胞团,观察可传代的囊胚内细胞团数与原代胚胎干细胞的克隆形成率。⑥对培养的胚胎干细胞进行Oct-4染色和碱性磷酸酶染色鉴定,并检测其体外分化能力。结果:①不同培养系统对孵出囊胚状态的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统:KSOM液滴中处于囊胚内细胞团状态的囊胚腔逐渐增大,待取出时胚胎扩展更加充分,一侧突出一个大泡但未突破透明带,此为正在孵出的囊胚。孵出后仍维持有腔的囊胚状态,表明胚胎的质量良好。移入饲养层后即贴壁,囊胚内细胞团开始增殖。单纯胚胎干细胞培养系统:囊胚培养24h后开始孵出并贴壁,囊胚内细胞团逐渐增大,最后将囊胚腔充满。②不同培养系统对原代胚胎干细胞克隆形成率的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统、单纯胚胎干细胞培养系统的囊胚总数分别为154只和131只,差异无显著性意义(P>0.05);两种培养系统的囊胚内细胞团可传代数量分别为89只和80只,增殖到能够离散的程度基本相似(57.8%,20.1%,P>0.05);原代胚胎干细胞囊胚内细胞团离散后出现集落数分别为31个和38个,克隆形成率差异无显著性意义(20.1%,29.0%,P>0.05)。③胚胎干细胞鉴定结果:第5代胚胎干细胞Oct-4染色和碱性磷酸酶染色均呈阳性。④胚胎干细胞体外分化能力检测结果:胚胎干细胞团块悬浮培养4d时,形成由上百个细胞组成的球状拟胚体。结论:①单纯胚胎干细胞培养液一步法与KSOM-胚胎干细胞培养液两步法孵出囊胚所获得的胚胎干细胞集落形态类似,均具有胚胎干细胞的形态学特征,但后者在KSOM液培养阶段有利于囊胚孵出前的早期胚胎发育同步化。②两种培养方法得到的胚胎干细胞其增殖及克隆形成能力基本相似。

昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法。方法自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆。进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定。在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达。结果所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性。ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性。结论体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径。

昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞并诱导分化为胰岛素前体细胞的实验

目的:自囊胚内细胞团分离培养患者自身的胚胎干细胞并将其诱导分化为目的细胞可用于特定疾病的治疗。实验采用昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞,并将其诱导分化为胰岛素前体细胞。方法:实验于2005-09/2006-11在哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室完成。①选取妊娠3.5d昆明雌性小鼠123只,至13.5d时取11只用于胚胎成纤维细胞饲养层制备。剩余112只妊娠3.5d小鼠冲胚后,挑取扩展充分、囊胚内细胞团明显的囊胚采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法分离培养胚胎干细胞,进行碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色鉴定。②在细菌培养皿的盖上用不含人重组白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液制备液滴,选取生长旺盛、形态典型的胚胎干细胞集落,采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法悬浮培养4d,形成拟胚体,行巢蛋白免疫荧光染色。③将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞,首先需要L-多聚赖氨酸和纤维粘连蛋白包被培养皿,然后用ITSFn筛选液(含5mg/L胰岛素、50mg/L转铁蛋白、30nmol/L亚硒酸钠、5mg/L纤维粘连蛋白的DMEM/F12培养液)筛选巢蛋白阳性细胞6d,碱性成纤维细胞生长因子扩增及初步诱导6d,再以烟碱诱导功能成熟的胰岛素前体细胞27d。应用DTZ染色、Insulin免疫荧光染色对诱导的细胞进行鉴定。结果:①胚胎干细胞的分离培养:将扩展充分的囊胚放置在饲养层上4d后,可见囊胚内细胞团自透明带中孵出,呈柱状生长,中央颜色深于周边,并将周边的饲养层细胞推开。胚胎干细胞传代后呈典型的克隆样生长,相差显微镜下折光性强。②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色结果:两种染色均呈阳性表达。③拟胚体的形成及向巢蛋白阳性细胞的诱导:胚胎干细胞悬浮培养4d可形成拟胚体,经ITSFn筛选6d后可见90%巢蛋白阳性细胞。④巢蛋白阳性细胞向胰岛素前体细胞的分化:烟碱诱导6d后,上皮样细胞增多,细胞逐渐密集形成类胰岛样组织。诱导10dDTZ染色可见集落的边缘细胞被染成腥红色。诱导27dInsulin免疫荧光染色可见染色阳性细胞团簇。结论:采用昆明小鼠3.5d囊胚成功分离培养胚胎干细胞,并可以将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞。

胚胎干细胞向心肌细胞方向诱导分化的进展

胚胎干细胞是具有在体外无限扩增且可向外、中、内三胚层分化的全能干细胞。在体外可以通过自主分化、加入药物、加入生理活性物质、共培养以及转基因等方法对其进行诱导和调节生成心肌细胞,为心肌梗死等心脏重大疾病患者实施细胞治疗提供理想的种子细胞。

悬滴法检测小鼠胚胎干细胞AKP的表达

目的 采用悬滴法和传统细胞爬片法对胚胎干细胞等呈集落样生长的细胞进行检测。方法 取3．5天昆明小鼠胚胎放在KSOM培养液中，体外培养24h后，将孵出的ICM放在铺有饲养层的胚胎干细胞培养液中，4-5d待ICM呈柱状生长时，消化传代，并应用悬滴法和普通爬片法检测小鼠胚胎干细胞AKP表达。结果 分离、培养的小鼠胚胎干细胞体积小，细胞核大，细胞界限不清，呈集落样生长。应用悬滴法和普通爬片法对其进行AKP染色后，小鼠胚胎干细胞呈蓝紫着色。结论 悬滴法与传统的细胞爬片法相比，可以减少细胞丢失，利用较少的细胞即可成功的检测，明显提高了小鼠胚胎干细胞检测成功率。