ZZ亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备与初步应用

目的:构建、表达ZZ亲和肽与碱性磷酸酶(AP)融合蛋白,并研究其生物学活性。方法:将ZZ亲和肽基因与AP基因重组,构建原核表达载体p EZZ-AP并利用大肠杆菌表达,金属离子亲和层析纯化目的蛋白,Western blot鉴定ZZ-AP生物学活性并初步应用于免疫细胞化学。结果:所构建重组质粒p EZZ-AP经E.coli DH5α表达,SDS-PAGE结果显示目的蛋白相对分子量为62 k D,与理论值相近。Western blot结果表明ZZ-AP融合蛋白既具有兔Ig G抗体结合活性,又具有碱性磷酸酶活性,在细胞免疫组化应用中与AP标记的羊抗兔二抗显色模式与效果相似。结论:ZZ-AP融合蛋白构建成功,该融合蛋白具有兔Ig G抗体结合活性和碱性磷酸酶活性,细胞免疫组化应用结果表明该融合蛋白在免疫分析中具有潜在的应用价值。

调理食品有机固废好氧堆肥效果的工艺基础

针对食品剩余污泥特性,采用高温好氧堆肥工艺,用牛粪、米糠、木片作添加剂,探讨3组配比试验,即1号为原泥料∶食品剩余污泥∶牛粪∶米糠∶木片=1∶0.5∶0.34∶0.86(体积比,下同),2号为原泥料∶食品剩余污泥∶米糠∶木片=1∶0.5∶0.45∶0.71,3号为原泥料∶食品剩余污泥∶牛粪∶米糠∶木片=1∶0.5∶0.23∶0.56。结果显示,2号的效果最好,其温度、含水率、pH值、有机质含量、总有机碳含量最终为27.2℃、30.6%、6.8、64.5%、32.1%。

基于Avi-tag技术的双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白

目的:利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。方法:PCR方式扩增EGFP基因片段,重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体pdi-Avitag,构建原核表达载体p EGFP-(Avitag)2并转化E-.coli DH5α;表达菌株菌体冻融上清经金属离子亲和色谱纯化目的蛋白EGFP-(Avitag)2,以Bir A酶体外催化生物素分子与目的蛋白在Avi-tag位点的生物连接,并以Western blot和竞争ELISA鉴定生物素化产物EGFP-B2的生物素化效果。结果:成功构建p EGFP-(Avitag)2载体,并在E.coli DH5α中可溶性表达EGFP-(Avitag)2,经Western blot和竞争ELISA鉴定,EGFP-(Avitag)2分子经Bir A酶体外催化可连接两个生物素分子。结论:成功获得双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白,为其在BAS体系中的应用奠定了研究基础。

重组BirA酶的原核表达及其活性鉴定

构建含有r TEV酶切位点的原核表达载体p UC18-His-Bir A,利用E.coli DH5α表达重组Bir A酶,并通过酶切获得不含His标签肽的Bir A酶。PCR方式扩增Bir A基因片段重组至质粒p UC18,构建原核表达载体p UC18-His-Bir A并转化E.coli DH5α;采用冻融法释放菌体蛋白,SDS-PAGE分析目的蛋白的存在形式;冻融上清经金属离子亲和色谱纯化获得目的蛋白His-Bir A酶,利用r TEV酶切除His标签肽,并采用HABA方法进行Bir A酶活鉴定分析。经双酶切验证、基因测序结果表明重组载体构建正确,SDS-PAGE结果显示表达产物可溶部分比例约占50%;利用r TEV酶将标签切除,经HABA测定该酶相对酶活性可达4 365 U/μg。该研究通过构建p UC18-His-Bir A质粒表达载体,实现了重组Bir A酶较高比例的可溶性表达。表达产物经r TEV酶酶切后具有较高的酶活性,为实现Bir A酶的经济、高效制备奠定了一定的实验基础。