溶血相关基因缺失降低鳗弧菌感染花鲈的致病性

为阐明毒力因子溶血素对鳗弧菌感染花鲈过程中发挥的作用,实验以花鲈为研究对象,通过对花鲈幼鱼分别注射5.0×10^(5)CFU鳗弧菌野生株和缺失株△vah1-vah4-rtxA,评估了溶血相关基因缺失对花鲈的感染能力、花鲈各组织的病理变化情况以及免疫响应的影响。结果显示,花鲈感染野生株后的LD_(50)为2.103×10^(5)CFU/mL,感染缺失株△vah1-vah4-rtxA后LD_(50)为1.837×10^(6)CFU/mL,溶血相关基因缺失使鳗弧菌毒性降到原来的11.44%;鳗弧菌主要定植在花鲈的肠道和鳃中,溶血相关基因缺失降低鳗弧菌在花鲈体内的定植能力,同时降低对鳃和肠道的损伤程度;转录组分析表明vah1、vah4和rtxA缺失后,头肾组织的差异表达基因显著富集到造血细胞谱系、抗原处理和呈递、细胞黏附分子、肠道免疫网络的IgA生产等免疫通路,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对表达水平进行了验证。研究表明,溶血相关基因缺失降低了鳗弧菌感染花鲈的致病能力。研究结果有助于进一步了解鳗弧菌的致病机制,并为开发花鲈抗弧菌免疫增强剂或减毒疫苗提供依据。

延迟投饵对真鲷、牙鲆仔鱼早期阶段摄食、存活及生长的影响

试验结果表明：（１）２日龄真鲷、牙鲆仔鱼初次摄食，在６～７日龄和５～６日龄，不能建立外源性营养的仔鱼分别进入ＰＮＲ期，而卵黄囊均在此前１～２天已耗尽。混合营养期分别为３～４天和１～２天。（２）真鲷和牙鲆仔鱼在不同饥饿阶段初次摄食率的变化式型是：开始较低，此后逐步上升，高峰期出现在卵黄囊接近耗尽时，此后开始下降。记录到的最高初次摄食率分别为８６．７％和３５％。（３）牙鲆仔鱼体长的增长率随延迟投饵天数的增加而降低，牙鲆仔鱼的存活率与延迟投饵天数的关系也是如此。延迟２天投饵对真鲷仔鱼的存活率影响不大。

抑制差减杂交法克隆牙鲆变态早期差异表达的基因

为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因,采用抑制差减杂交法,以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA,建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库,并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右,阳性率为81.8%。随机测定的45个克隆,在剔除假阳性克隆后,共得到22个不同的基因,其中13个为已知cDNA的同源基因,而另外9个为已知蛋白的同源基因,分别为prolactin receptor-like,COL1A1,M-3muscarinic receptor,Sfrs3,tropomyosin,ribosomal protein L27,ribosomal protein S12,GAPDH,COL1A3。在所有22个基因中,COL1A1基因在差减库中的分布频率最高,为22.2%。RT-PCR检测结果表明,在所检测的11个基因中,所有基因在右眼移动前后的牙鲆头部均有表达,只是体现在表达水平上的不同。

牙鲆变态过程中的细胞凋亡

利用整体的原位TUNEL方法检测了牙鲆(Paralichthysolivaceus)变态过程中身体各器官细胞凋亡的分布及变化情况。结果如下:(1)与眼睛移动相关的脑颅骨骼的细胞凋亡右侧眼睛移动开始之后,在额骨、中筛软骨和犁骨软骨中出现细胞凋亡,并保持到眼睛移动结束;(2)中枢神经和感觉器官的细胞凋亡在眼睛移动开始之前,脊髓和脊髓鞘出现细胞凋亡,在眼睛移动开始之后,脊髓和脊髓鞘细胞凋亡停止,而在脑、眼睛和内耳出现细胞凋亡,并一直持续到眼睛移动结束;(3)与游泳、捕食和消化等功能相关的器官的细胞凋亡在眼睛移动开始后,冠状幼鳍的基部出现凋亡;在变态中后期,尾鳍基部出现细胞凋亡;下颌骨、鳃弓以及肝脏在眼睛移动开始之后,出现细胞凋亡,也一直持续到眼睛移动结束。细胞凋亡通过有序地去除多余的细胞来参与器官形态建立和重组,本研究的结果表明,在牙鲆器官功能变化过程中,细胞凋亡在与其相适应的的器官形态重塑中起着重要作用[动物学报52(2):355-361,2006]。

外源甲状腺素及可的松对牙鲆早期发育阶段生长、发育和变态的影响

通过外源甲状腺素（T4）及可的松浸泡卵和仔鱼，结果表明：外源甲状腺素（T4）和可的松对牙好卵的孵化率和初孵仔鱼的体长没有显著影响；外源甲状腺素（T4）对0～10日龄的仔鱼生长有显著影响，和对照组（0）相比，0．05×10-6和0．1×10－6的影响显著，外源可的松对0～10日龄的生长不显著；外源甲状腺素（T4）和可的松对11～24日龄仔鱼的生长不显著，外源甲状腺素（T4）对11～24日龄的仔鱼变态有显著影响，和对照组（0）相比，0．05×10－6和0．1×10-6的影响显著；外源可的松对11～24日龄的变态影响不显著。

斑点叉尾趋化因子SCYA126基因及其可变剪接

通过探针杂交筛选斑点叉尾(Ictalurus punctatus)BAC基因组文库,利用引物步移的方法对阳性克隆BAC047 K12进行序列测定,得到2 815 bp的SCYA126基因组序列。序列分析表明,SCYA126基因由2个外显子和1个内含子组成;外显子拼接的序列与SCYA126cDNA序列完全一致,编码92个氨基酸,在N端含有2个相邻的半胱氨酸(CC)和2个不相邻的半胱氨酸,为典型的CC趋化因子亚家族成员;其上游调控序列包含TATA框启动子序列和一些与免疫相关的转录因子结合位点。另外,根据与GenBank接收号为BM029630的EST序列的比较分析,发现SCYA126基因组中的内含子没有被剪接,导致翻译后可能产生N端部分缺失的SCYA126蛋白。在胰脏和肝脏中确认了高表达的包含内含子的mRNA的存在,而且其表达量要明显高于正常剪接的SCYA126mRNA。[中国水产科学,2007,14(1):1-7]

饥饿状态下真鲷仔鱼早期阶段的高温、低盐耐力和浮力

（1）真鲷初孵仔鱼的高温和低盐耐力分别为30℃和3．8‰，随饥饿程度加剧，耐力逐渐下降至27℃和6．5‰，投饵仔鱼随着发育推进，耐高温能力增强，而低盐耐力出现波劝。（2）真鲷早期仔鱼的低盐耐力和浮力变化与仔鱼体内水分含量有关。（3）开口后3日龄和PNR是真鲷仔鱼对外界环境的敏感期，其时高温和低盐耐力很低。（4）真鲷受精卵的水分含量达92．6％，初孵仔鱼上浮，开口后开始下沉，至卵黄囊消失下沉速度达到最大。

从福尔马林保存的牙鲆中克隆的18SrDNA进行系统发育分析的可靠性

从福尔马林保存的牙鲆和活体牙鲆肌肉组织中,利用基因拼接的方法首次克隆到1205bp和1295bp的长片段序列。福尔马林保存标本与活体标本DNA序列的同源率为82%;和活体标本的18SrDNA序列相比,标本DNA的碱基缺失率为7%,碱基替换比例为11%。利用福尔马林标本的18SrDNA同源性高的区域进行系统发育分析,表明其结果是可信的。

鮰鱼SCYA107基因序列的比较分析

筛选BAC基因组文库得到阳性克隆后,利用引物步移法测定斑点叉尾SCYA 107基因组序列。该基因由四个外显子和三个内含子组成;外显子拼接的序列与cDNA序列完全一致,编码96个氨基酸,在N端含有两个相邻的半胱氨酸(CC)和两个不相邻的半胱氨酸,为典型的CC趋化因子亚家族成员;其上游调控序列有一些与免疫相关的转录因子结合位点;斑点叉尾SCYA 107氨基酸的结构和功能与小鼠趋化因子CCL 20比较接近,而蓝叉尾则更接近人CCL 8,它们氨基酸序列的差别是由于斑点叉尾SCYA 107基因序列中多了ACAAA这5个核苷酸,导致读码框移位提前出现终止子TGA所造成的。

暗纹东方鲀仔鱼早期发育阶段摄食和行为的研究

研究结果表明 :1.在 4～ 10日龄内 ,暗纹东方 ( Takifugu obscurus)仔鱼摄取的蛋黄颗粒越来越大 ,4日龄仔鱼对粒径 0 .12 5～ 0 .2 60 mm的蛋黄颗粒的摄食率最高 ,10日龄仔鱼以0 .191～ 0 .30 9mm的为最高。2 .6～ 10日龄仔鱼的摄食率在光照 4 0 0～ 30 0 0 lx的范围内以 10 0 0～ 2 0 0 0 lx为最好 ,但没有显著影响。 3.3日龄仔鱼以间歇式巡游为主 ,至 7日龄才建立起完全的巡游模式。 4 .仔鱼摄食行为的发育分为较明显的两个阶段 :一是前期仔鱼的前冲摄食 ,二是后期仔鱼身体呈现“L”攻击型和“咬食攻击型”的姿势摄食 ;12日龄之后 。

低等真骨鱼类肌间骨的比较分析

对骨舌鱼总目、海鲢总目、鲱形总目和骨鳔总目等低等真骨鱼类肌间骨的数量、形态和分布进行了比较分析，结果如下：1．海鳗肌间骨的数目最多（409枚），其次是刀鲚（221枚），黄颡鱼肌间骨数最少（8枚），双须骨舌鱼次之（70枚），鲤科鱼类的肌间骨数目在99～133之间。2．从骨舌鱼总目到骨鳔总目，各种肌间骨可归纳为7种形态类型，从简单形态向复杂形态演化，然后出现退化现象。双须骨舌鱼只有形态最简单的“I”形髓弓小骨，没有脉弓小骨；海鲢总目的海鳗出现一端两分叉的形态，而鲱形总目的鲥和刀鲚出现一端多分叉的形态，到骨鳔总目的各种鱼类，开始出现两端两分叉，并在此基础上出现各种更复杂的形态；肌间骨形态在鲤科的鲒亚科最复杂，从雅罗鱼亚科开始退化，到鲇形目髓弓小骨完全消失，而脉弓小骨仅留少数简单的I形；脉弓小骨形态的复杂性要比髓弓小骨低。3．从前向后，髓弓小骨形态依照从复杂到简单的顺序排列，而脉弓小骨没有这种明显的排列顺序。根据低等真骨鱼类的系统发育关系，结合肌间骨形态及其在各肌间隔的分布规律，本文认为，目前鲤科鱼类的各种肌间骨是通过两个途径演化而来的：从“I”形-“卜”形-“Y”形-一端多叉形和从“I”形-“卜”形-“Y”形-两端两分叉形-两端多叉形-树枝形。

鲢肌间小骨发育的形态学观察

分别利用形态解剖和整体骨骼染色的方法,对鲢(Hypophthalmichthys molitrix)成鱼肌间小骨的形态、分布,以及仔、稚鱼肌间小骨的形态发生和出现进行观察。结果表明,鲢肌间小骨有I形、卜形、y形、一端多叉形、两端多叉形和树枝形6种类型,肌间小骨越靠前端形态越复杂。肌间小骨在43dpf首先出现在尾部,然后往前依次出现,到55dpf全部出现。出现一枚髓弓小骨的仔鱼最小体长是10.50mm,出现一枚脉弓小骨的仔鱼最小体长是13.66mm。各种复杂形态的肌间小骨均是从I形发展而来。本文结果为今后研究肌间小骨发生的分子机制提供了形态学基础。

利用PCR-DGGE法分析暗纹东方鲀的弧菌菌落组成

采用16S rDNA特征序列PCR-DGGE法,分析了不同饵料饲养的暗纹东方的表皮、性腺和肠道中,以弧菌为主的细菌群落的组成。结果表明:(1)共鉴定出暗纹东方体内18种微生物,均归属于变形细菌的gamma亚群,其中13种为弧菌科细菌,3种为肠杆菌科细菌,2种为气单胞菌属细菌;(2)投喂鲜活鱼虾的与投喂人工配合饲料的暗纹东方肠道和性腺中的细菌组成是不同的,在性腺中分离到的所有12种细菌中,只有2种细菌是相同的,约占17%;在肠道中分离到的所有13种细菌中,有4种是相同的,约占31%。而在表皮上所分离到的11种细菌中,有7种细菌是相同的,约占64%;(3)DGGE特征条带V1、V13、V18、V14和V17所代表的细菌只在表皮组织被分离到,V6所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方性腺中,V5所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方肠道中;(4)DGGE特征条带V5、V8、V13、V18、V6、V14和V17所代表的细菌不能在TCBS培养基上培养,占18种被鉴定的细菌总数的39%。

中国五大湖三角帆蚌群体遗传多样性的RAPD分析

用OPJ和OPM两组40条10碱基随机引物,对中国五大湖三角帆蚌地理群体及诸暨养殖蚌进行了随机扩增多态性DNA(RAPD)分析,其中12个引物的扩增结果具有丰富的群体多态性,多态率为55.6%～80%。群体内遗传相似度大小依次为:鄱阳湖(0.8889),太湖(0.8694),洞庭湖(0.8111),诸暨(0.7746),洪泽湖(0.7348),巢湖(0.7185)。依据群体间遗传距离指数及分子系统树,表明洞庭湖群体和洪泽湖群体亲缘关系最近,鄱阳湖群体则与巢湖群体的亲缘关系最近,并且诸暨人工养殖群体与鄱阳湖和巢湖的群体比较接近。

16S rDNA文库法分析草鱼肝胰脏和胆汁细菌群落组成

利用16S rDNA文库随机测序法分析了草鱼肝胰脏和胆汁细菌菌落组成,结果表明,在肝胰脏中共鉴定出19种共生细菌,分别隶属于气单胞菌属、假单胞菌属、摩根菌属、不动杆菌属、弧菌属和变形杆菌属。气单胞菌属和假单胞菌属为优势属,气单胞菌属的丰度为36.17%,假单胞菌属为31.91%。其中,气单胞菌属的GZ16和假单胞菌属的GZ9菌株丰度最高,均为12.77%。在胆汁中共鉴定出10种共生细菌,分别隶属于气单胞菌属、假单胞菌属、摩根菌属和变形杆菌属。气单胞菌属和假单胞菌属为优势属,气单胞菌属的丰度为35%,假单胞菌属为27.5%。其中,变形杆菌属的DN1菌株丰度最高,为25%。肝胰脏中只有10.5%的细菌群落与胆汁的细菌群落相似,胆汁中只有20%的细菌群落与肝胰脏相似,表明草鱼肝胰脏和胆汁有各自特有的共生细菌群落。本研究结果,为进一步探讨肝胰脏和胆汁共生细菌的生理功能,以及细菌与宿主草鱼之间的协同进化提供了基础。

银鲳皮肤和肌肉组织的基因表达谱分析

采用目前国际上最为通用的cDNA文库构建方法,构建了银鲳皮肤和肌肉组织的cDNA文库,通过一定规模的序列测定,并借助生物信息学技术,分析了164个序列,得到了105个不同的基因(或表达序列标签),在105个不同的基因中,68.6%基因没有冗余,1倍、2倍、3倍和4倍冗余的分别占23.8%,3.8%,2.8%和1%。皮肤和肌肉组织表达基因的组成中,除了21个没有同源序列的未知基因外,可初步归为代谢相关的酶(38个)、DNA有关的酶(7个)、结构蛋白(4个)、膜蛋白(13个)、线粒体蛋白(1个)、转录因子(9个)、信号传导相关的蛋白(10个)和未知蛋白(2个)等8大类,其中,转录因子、膜蛋白,和DNA有关的酶的基因冗余程度相对较高。这些研究结果,为积累银鲳遗传方面的基础信息,了解银鲳皮肤和肌肉组织的基因表达提供了较好的研究基础。

牙鲆仔鱼早期阶段的摄食能力

本文主要在实际观察值的基础上，利用发育反应方程Ｃ＝ＫＷＹ与功能反应Ｈｏｌｌｉｎｇ、Ｉｖｌｅｖ方程对２～１０日龄的牙鲆仔鱼的摄食能力进行了计算与预测。其结果表明：牙鲆仔鱼在２～６日龄、轮虫饵料密度不超过３０００ｉｎｄ· Ｌ－１的水体中，摄食强度不超过 １７ μｇ· ｈ－１；随着日龄的增加，摄食强度迅速增强，在 ４、６、 １０日龄、饵料密度为３０００ｉｎｄ·Ｌ－１的水体中，摄食强度分别是１．３５、１．６８、３．８９μｇ·ｈ－１。牙鲆仔鱼的摄食发生率随仔鱼的发育而加大，仔鱼在 ２日龄、饵料密度为 １５ ０００ ｉｎｄ·Ｌ－１的水体中，其摄食发生率仅为 ０．６９μｇ·ｈ－１，而在 １０．４日龄时，同饵料密度下的摄食发生率为１８．７２ μｇ·ｈ－１，后者是前者的２７倍。食饵操纵时间、饵料搜寻时间随仔鱼的发育而迅速下降：仔鱼在２、１０．４日龄的食饵操纵时间分别为０．４８５、０．０４０ ｈ．μｇ－１，前者是后者的 １２倍多，而在饵料密度为 １５ ０００ ｉｎｄ·Ｌ－１下，搜寻时间分别为 １４４９、００５３ ｈ．μｇ－１，前者又是后者的 ２７倍多，亦即是说，仔鱼在初孵前几天的摄食能力较低，到后期逐步提高。