猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析

[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化,以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性,通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带,表明重组病毒纯化成功,再通过PCR验证RFP基因有目的条带,表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示,与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F 1—F 10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象,表明重组病毒可稳定表达外源基因;测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线,重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株,为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。

猫杯状病毒反向遗传系统的建立及弱毒株的构建

为了构建猫杯状病毒(FCV)弱毒疫苗候选株,从杭州流行的FCV毒株FCV-HZ-DF-19中提取基因组RNA,利用RT-PCR技术分3段扩增获得FCV全基因组,通过同源重组的方法将全长基因组克隆至已插入榔头状核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)的PCI载体,获得中间质粒pPCI-FCV;以pPCI-FCV为模板扩增获得含HamRz、HdvRz和FCV全基因组的产物FCV-H,并将其连接到BAC载体中获得含有FCV全基因组的克隆pBAC-FCV。将pBAC-FCV转染猫肾细胞F81连续传代后收获病毒。针对FCV毒力相关的LC基因进行缺失,获得感染性克隆pBAC-FCV-ΔLC,通过转染表达FCV-VP1蛋白的猫肾细胞系进行病毒拯救。结果显示,拯救毒株rBAC-FCV和LC基因缺失毒株rBAC-FCV-ΔLC均可产生细胞病变;测序结果表明,拯救毒株的基因序列与亲本毒株FCV-HZ-DF-19一致,且生长曲线与亲本毒相似,而基因缺失毒株的生长则慢于亲本毒株,产生的噬斑大小也明显小于亲本毒株,表明缺失LC基因后病毒毒力下降。结论:本研究成功构建了FCV的反向遗传系统及基因缺失弱毒株,为后续弱毒疫苗研发和FCV生物学特性研究奠定了基础。

全国部分地区H9亚型禽流感病毒分子流行病学和遗传变异分析

旨在了解2020—2021年间全国部分地区H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)的分子流行病学和遗传变异情况,因此从全国部分地区采集到10336份临床样本进行了H9-AIV包括核酸检测、病毒分离、HA基因测序和遗传变异等方面的分析。病原核酸检测结果显示,AIV-H9阳性率为16.1%(1665/10336),白羽肉鸡中的检出率最高,商品肉鸡检出率高于蛋鸡。本研究获得920株H9-AIV分离株,其中464个代表性毒株的遗传进化分析显示,所有分离株全部位于h9.2.4.5分支,且均为典型低致病性AIV,与WJ57毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为92.2%~99.9%和89.6%~99.8%;结合关键氨基酸位点分析,这些分离株逐步向哺乳动物适应性和气溶胶传播方向发生变异。以上数据表明,H9-AIV分离株进一步增强了对哺乳动物的感染力且传播力不断加强,因此持续监控其检出和变异对家禽健康养殖、人类健康至关重要。

鹅星状病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAstVⅠ和GAstVⅡ的保守区域RdRp基因序列,设计合成2对特异性引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了一种双重荧光定量PCR检测方法,以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstVⅠ和GAstVⅡ的目的。结果显示,GAstVⅠ和GAstVⅡ的最小检出量分别为43.3、6.49 copies·μL^(-1);重复试验的变异系数不超过0.5%;该方法对DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)等病毒核酸无交叉反应。综上表明,本研究建立的可鉴别GAstVⅠ和GAstVⅡ的双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断,也可用于两种基因型GAstV的定量分析。

肉鸡热应激病理损伤与应激蛋白(HSP_(70))相关性研究

通过血液临床病理学、组织学和免疫组织化学检测技术,对AA肉鸡进行了为期10 h的急性热应激,观察分析了高热应激状态下受试鸡组织损伤及其与HSP70的相关性。热应激受试鸡组织脏器在应激初期即开始出现较明显的组织病理学改变,表现为心肌纤维、肾小管上皮细胞等呈现不同程度的变性、坏死等退行性变化;外周血液中反映受试鸡心肌等细胞组织损伤的肌酸激酶(对照)活性显著升高;反映鸡体基础代谢水平的甲状腺素T3和T4、胰岛素则呈现不同程度的下降趋势。应激持续较长时间(10 h)后受试鸡外周血液中对照含量下降的幅度明显趋缓的现象可能与持续应激状态下心肌纤维内产生大量HSP70而产生保护性反应有关,HSP70在各组织脏器血管壁上的强阳性分布提示HSP70与血管功能密切相关。

鸭圆环病毒无核定位信号衣壳蛋白的原核表达及其在间接ELISA中的应用

鸭圆环病毒(DuCV)是一种具有长期免疫抑制特性的病原体,其Cap蛋白是DuCV的主要结构蛋白和主要免疫保护抗原,构成病毒的核衣壳,对DuCV的血清学诊断具有重要意义。为了开发出适合DuCV的检测方法,本研究在重组Rosetta大肠杆菌细胞内对无核定位信号的DuCV Cap蛋白进行了表达,建立了基于无核定位信号Cap蛋白检测DuCV血清抗体的间接ELISA方法(Cap-ELISA)。结果:Cap-ELISA包被抗原的最佳浓度为280 ng/孔,血清稀释比为1∶1600;检测样本的阴阳临界值为0.339,灵敏度达到1∶12800,并对DuCV抗体检测具有特异性;与常规PCR方法的符合率为92.7%,用Cap-ELISA对山东部分地区的樱桃谷鸭血清进行了间接ELISA检测,总阳性率为88.9%,说明该方法适合在DuCV血清学诊断中应用。

马立克氏病疫苗胚胎免疫鸡红细胞免疫功能的研究

作者检测了胚胎免疫鸡 (孵化至 18日龄时鸡胚接种马立克氏病二价疫苗 )及其相应 1日龄免疫鸡和未免疫鸡的红细胞CR1花环率和红细胞IC花环率以观察其外周血液红细胞免疫功能。结果表明 ,随着试验鸡日龄的增长 ,其外周血液中红细胞CR1活性呈现一定的递减性变化 ,但胚胎免疫鸡红细胞CR1活性的降低幅度远低于其它两组鸡。胚免鸡出壳后 7日龄进行vMDV攻毒 ,结果也显示胚胎免疫可显著阻止红细胞免疫功能的下降。此外 ,胚免组鸡血清中红细胞免疫粘附抑制因子活性下降 (IC形成减少 ) 。

胚胎免疫火鸡疱疹病毒后鸡淋巴器官的超微结构观察

用火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）疫苗对孵化至１８日龄的鸡胚胎进行免疫注射。超微结构观察显示，１８日龄胚胎免疫鸡出壳后对淋巴器官的早期发育具有明显的免疫促进作用；而鸡马立克氏病毒（ＭＤＶ）攻毒试验的结果则表明，非免疫鸡出现较明显的淋巴样细胞的退行性变化。

运输应激猪骨骼肌中热应激蛋白HSP_(70)和HSP_(90)家族的表达

利用Westernblot技术 ,检测长途运输试验猪骨骼肌 (背最长肌和臀大肌 )中分属于HSP70 家族和HSP90 家族的 4种应激蛋白 (HSP70 ,HSP72 ,HSP86和HSP90 )的表达。所有运输应激猪和对照猪肌肉组织中均检测到了上述 4种HSP。对照猪组织中HSP的表达说明HSP除了在受应激的细胞内行使生理功能外 ,还具有独立于应激刺激应答以外的其它作用。6h的长途运输后 ,HSP的表达量明显不同 ,HSP70 和HSP72 在肌肉组织中的表达虽然有一定的增加 ,但统计学分析差异不显著 (P >0 0 5 ) ;而HSP86和HSP90 在骨骼肌中的表达明显下降 ,尤以HSP90 下降最为显著 (P <0 0 1)。提示HSP90 家族成员与肉品品质相关 。

马立克氏病(MD)胚胎免疫攻毒后病毒抗原的定位研究

本试验利用异硫氰酸荧光黄标记抗体和免疫金标记探针，对胚胎免疫攻毒试验鸡组织脏器中马立克氏病病毒（ＭＤＶ）抗原进行定位及动态观察。结果发现，不同组织细胞内ＭＤＶ抗原的表现形态略有不同，淋巴组织中阳性细胞内ＭＤＶ抗原多呈颗粒状或斑点状定位于细胞浆、细胞核内；脏器组织中阳性着染的实质细胞内病毒抗原则主要呈均匀弥散性分布于感染细胞（肾小管上皮细胞、肝细胞）的胞浆中而不发生瘤变。阳性细胞动态观察的结果则显示，胚胎免疫组试验鸡虽然不能阻止ＭＤＶ的感染，但却能明显降低ＭＤ肿瘤的转化率。不过。

运输应激猪肝脏中热应激蛋白的定位与表达

利用免疫组织化学定位方法和Westernblot技术 ,对长途运输试验猪肝脏中 5种不同分子量的热应激蛋白HSP70 、HSP72 、HSP86、HSP90 和HSP2 7进行定位和表达。所有长途运输后应激猪和对照猪肝脏组织中均同时检测到了上述 5种HSP。肝细胞胞浆和胞核均显示阳性信号 ,但HSPs在肝细胞中的定位有差异 ,大多数HSP70 、HSP72 和HSP2 7主要分布于肝细胞胞浆内 ,而HSP90 和HSP86阳性颗粒在核内的分布比其在胞浆中的分布更为明显。肝小叶周边区有明显颗粒变性和脂肪变性的肝细胞中HSPs的阳性染色信号较弱。 6h的长途运输应激后 ,与对照组相比 ,HSPs在肝脏组织中的表达量存在差异 ,表现为HSP70 家族的HSP70 和HSP72 的表达没有明显的升高 (P >0 .0 5 ) ,HSP90 家族的HSP90 的表达出现极显著的增加 (P <0 .0 1) ,然而 ,HSP90 家族的HSP86和小分子量家族的HSP2 7的表达量呈现明显的下降 (P <0 .0 5 )。

马立克氏病胚胎免疫的保护力试验

马立克氏病胚胎免疫的保护力试验鲍恩东陈万芳（南京农业大学动物医学院２１００９５）张贤（宁夏农学院）张白银（江苏省句容农校）环境中广泛存在的马立克氏病病毒（ＭＤＶ），常使免疫雏鸡在产生免疫力之前感染而导致免疫失败以及火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）疫苗免疫力下降...

鸡马立克氏病胚胎免疫后淋巴器官免疫效果的观察

用火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）疫苗对孵化至１８日龄的鸡胚进行胚胎免疫注射，免疫后出壳雏鸡淋巴脏器的组织学和组织化学显示，１８日龄胚胎免疫鸡对淋巴器官的早期发育具有明显的免疫促进作用。

鸡胚免疫系统器官组织学变化观察

鸡胚免疫系统器官组织学变化观察鲍恩东，陈万芳（南京农业大学动物医学院２１００９５）鸡胚孵化至后期，其免疫系统器官已基本成熟，因而进行鸡胚免疫是可行的。有关鸡胚免疫的研究多见于血凝抑制（ＨＩ）抗体滴度的测定及免疫保护率的试验。本项研究旨在通过对孵化１０...

鸡胚胸腺的组织发育

连续观察孵化至１４～２１日龄的鸡胚胸腺，详细描述了早日龄鸡胚胸腺的组织学分化发育过程。结果显示，胸腺完整组织结构的形成约在１８日龄。２１日龄出现的非炎性异嗜性细胞在胸腺组织分化发育过程中所起的作用值得注意。

硒-维生素E结合体对雏鸡自然杀伤(NK)细胞活性和T淋巴细胞转化率的影响

１５０羽雏鸡随机分为５组，Ⅰ～Ⅲ组于７日龄（ＮＤ首次免疫前３天）分别在饲料中添加硒－ＶＥ结合体２５，１５，５ｍｇ／ｋｇ，Ⅳ组添加ＶＥ１５ｍｇ／ｋｇ，Ⅴ组为空白对照，观察了硒－ＶＥ结合体对雏鸡血液中ＮＫ细胞活性和脾脏Ｔ淋巴细胞转化率的动态变化。结果显示，硒、ＶＥ的适度配合使用具有协同作用，能明显提高ＮＫ细胞活性和Ｔ淋巴细胞转化率，但在一定范围内，其效果受使用剂量的显著影响。停止投服硒－ＶＥ结合体后，ＮＫ细胞活性和Ｔ淋巴细胞转化率可在一段时间内维持较高水平。

鸡胚法氏囊的组织发育

本试验通过对孵化至１３～２１ 日龄的鸡胚法氏囊进行组织学的连续性动态观察，较为详细地描述了早日龄鸡胚法氏囊的组织学分化发育过程。实验结果显示，直至出壳前鸡胚法氏囊尚未形成较完整的能组织起有效体液免疫促进作用的组织基础结构，其完善的形态结构需在后天环境中分化和发育。非炎性状态下法氏囊淋巴滤泡内自始至终出现的异嗜性细胞在法氏囊的分化发育中起重要的组织改建作用。

鸡传染性法氏囊病细胞苗的病理致病性研究

鸡传染性法氏囊病细胞苗的病理致病性研究鲍恩东，张贤，徐秀荣（宁夏农学院永宁７５０１０５）目前，我国引进和研究的鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）疫苗种类不多，尚未筛选出一种免疫效果比较理想的疫苗。林英华等（１９８５）在实验室条件下曾证明ＰＢＧ＿（９８）鸡胚疫...

兔病毒性出血症的病理形态学及发病机理的研究

兔病毒性血症是兔的一种具有高度传染性的急性败血性传染病。自1984年2月江苏无锡地区首次爆发流行以来,目前已波及到全国几乎所有的省份,给养兔业带来了灾难性的打击。刘胜江等首次报道并确认本病是由病毒所引起的。兔出血症病毒(RHV)只引起兔只发病,主要造成青年和成年兔的发病和死亡。实验室研究和临床实践表明本病利用抗生素和磺胺类药物治疗无效,主要依靠紧急预防接种以控制疫情。为进一步探讨本病的病理形态学及其发病机理,本研究采用免疫荧光技术。

马立克氏病胚胎免疫雏鸡体重和免疫器官增重变化

１８日龄鸡胚免疫接种火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）疫苗后，对出壳后雏鸡及其用马立克氏病（ＭＤ）病毒攻毒鸡体重与免疫器官增长效果的对比研究表明：相同饲养条件下胚胎免疫雏鸡的增长速度高于非免疫对照鸡，而且胚胎免疫组雏鸡免疫器官的生长发育普遍较相应的对照组雏鸡快。