中国强毒力赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因的克隆表达及对大肠杆菌活力的影响

目的 :构建表达致病性赖型 0 17株钩端螺旋体OmpL1外膜蛋白的真核 -原核穿梭表达载体 ,并在原核细胞中表达出目的蛋白。方法 :用PCR方法从 0 17株钩体基因组中钓出OmpL1蛋白基因 ,酶切纯化后与质粒pBK -CMV连接 ,通过电泳、限制性内切酶分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后提取总蛋白以SDS -PAGE检测表达情况 ,同时监测目的蛋白表达前后各时段宿主菌OD6 0 0值的变化。结果 :筛选出 5株带重组质粒菌 ,其中有 4株能在大肠杆菌中表达 37kD的特异蛋白 ,而且随着该外源蛋白的表达 ,宿主菌生长各时段的OD6 0 0值下降。结论 :成功地构建了钩体OmpL1蛋白的穿梭表达质粒 ,并在大肠杆菌中表达出OmpL1融合蛋白 ,该异源蛋白的表达导致宿主菌的活力降低。本工作为OmpL1蛋白用于钩体病诊断。

莱姆病螺旋体83kd抗原蛋白基因特异性区段真核及原核表达型载体的构建

从莱姆病螺旋体染色体编码８３ｋｄ抗原蛋白（Ｐ８３）基因序列中选择编码近Ｃ端１５９个氨基酸的基因序列作为扩增的靶序列，自行设计并合成一对寡核苷酸引物，以莱姆病螺旋体Ｂ３１株基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得到约４７７ｂｐ的扩增片段，再把该片段与质粒载体ｐＢＫ－ＣＭＶ进行重组，经鉴定得到重组质粒ｐＢＸ１。重组质粒ｐＢＸ１可同时在真核和原核细胞中表达，其表达产物可用来制备莱姆病血清学诊断用的标准抗原；该重组质粒也可用来制备用于对莱姆病螺旋体进行分类鉴定的核酸探针。

聚合酶链反应检测致病性钩端螺旋体微量DNA的研究

作者通过对黄疸出血群钩端螺旋体DNA的分子克隆和筛选,获得了两个重组DNA片段,其中一个具有广泛针对各群致病性构体的特性,另一个仅对黄疸出血群钩体起杂交反应。经DNA序列分析和限制性谱测定,分别合成两对聚合酶链反应寡核苷酸引物——引物B1、2和引物B3、4。以该引物对各群、型钩体微量DNA(0.1 ng)行聚合酶链扩增反应,引物B1、2能引导扩增全部致病性钩体DNA,引物B3、4则特异性地扩增黄疸出血群钩体DNA,非致病性钩体和其他微生物DNA均无扩增反应。结果表明,聚合酶链反应是一种灵敏度极高、针对性很强的DNA扩增技术,可用于钩体病早期诊断和流行病学分类鉴定。

钩端螺旋体重组DNA探针对致病性黄疸出血群钩体DNA的杂交识别

作者从建立的黄疸出血群钩端螺旋体(下称钩体)DNA基因库中筛选出重组DNA克隆PLIps01(15kb)和PLIEc34(4kb)制备成^(32)P放射性探针。以该二探针对致病性黄疸出血群所属血清型的13个菌株钩体DNA进行Southern印迹分析,结果表明,该二DNA探什对黄疸出血群各株钩体DNA具有强烈的特异性结合,能识别出简洁的DNA带型,并能区分不同血清型以至菌株的DNA带型差别。作者认为,钩体DNA重组探什结合Southern印迹分析是一种灵敏而特异的检测分析方法,可作为诊断、鉴定和分析钩体的工具。

钩端螺旋体糖脂蛋白对培养血管内皮细胞的粘附导致细胞内吞与病损

作者提取不同群、型和毒力的构端螺旋体糖脂蛋白,以Rhodamine B荧光素和胶体金标记制备成探针,与体外培养的牛主动脉内皮细胞作用,以荧光显微镜和扫描电镜观察记录其过程,并以内皮细胞LDH、AcP漏出率和蛋白含量及细胞形态学作为细胞毒指标。结果表明,钧端螺旋体糖脂蛋白通过对培养血管内皮细胞的粘附,导致细胞内吞与病损。该过程可能属于一种特殊的受体介导内吞过程。

致病性钩端螺旋体微量DNA的聚合酶链反应(PCR)

本研究首次通过对黄疸出血群钩端螺旋体 DNA 的分子克隆的反复筛选,获得了两个重组DNA片段,其中一个具有广泛针对各群致病性钩体的特性,另一个仅对黄疸出血群钩体起杂交反应。经 DNA 序列分析,分别合成两对 PCR 寡核苷酸引物——Primer B1.2和 Primer B3.4。本研究证明 PCR 是一种灵敏度极高,针对性很强的 DNA 检测技术,可用于钩体病早期诊断和流行病学分类鉴定。

钩端螺旋体的DNA研究进展

<正> 钩端螺旋体(下称钩体)DNA探索性研究工作起始于60年代末期。美国乔治敦大学Haapala等用冷酚法提取在培养过程中加入~3H胸腺嘧啶核苷的数株钩体DNA,利用热解链温度(T_m)曲线和浮力密度法(Buoyanty density)确定其硷基配对组成(G+C),并通过标记在DNA上的~H测定特异性核双倍体形成,以了解其遗传相关性。结果表明,致病钩体根据其G+C百分率可分为两组,同组钩体DNA有很高程度的遗传相关性,而组间钩体则几乎缺如。从而提出,钩体DNA的组成可能与其生物学特性有某种关系。

早期钩体病患者血清钩体DNA聚合酶链反应和地高辛—硷性磷酸酶发光体探针杂交分析

作者从已建立的问号钩体基因文库中筛选合成一对引物G_1G_2,中国四川14份早期钩体病患者血清中的DNA经硫酸氰胍、二氧化硅和蛋白酶K纯化后,在G_1G_2引导下行聚合酶链反应(PCB),并以地高辛标记的同源探针行DNA印迹杂交,全部血清样品均获得确切地阳性结果。用地高辛—硷性磷酸酶发光体标记PCR扩增的同源DNA探针,与16株Yasuda基因组钩体作DNA印迹分析,其中8株存在同源单拷贝序列,它们皆为我国常见和流行的优势致病菌株,本研究结果表明:引物G_1G_2可用于四川钩体PCR检测和分析,PCR常规结合同源DNA探针杂交识别,能提高其敏感性和可靠性;地高辛—硷性磷酸酶发光体配合PCR等方法,可使微量DNA的检测和分析更趋完善。同时,本研究还提供了有价值的钩体DNA同源序列资料。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶(6kDaearlysecretoryantigenictarget,ESAT6)和培养滤液蛋白10(culturefiltrateprotein10,CFP10)的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a(+)构建成重组质粒pET-cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western-blot和ELISA分析。结果重组质粒pET-cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功(1∶106)。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。

人LAK细胞免疫效应分子HMGN2的鉴定

为分离纯化人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)小分子抗菌多肽,应用制备尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反向高效液相色谱技术分离纯化人LAK细胞酸溶性提取物,纯化出一个具抗菌活性的多肽HLP-3p21.蛋白质N端氨基酸测序、质谱精确分子质量测定、蛋白质印迹分析证明HLP-3p21为HMGN2.最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)试验证明HMGN2有抗大肠杆菌ML-35p氨苄青霉素耐药株、铜绿假单胞菌ATCC27853、白色念珠菌ATCC10231活性,无抗金黄色葡萄球菌ATCC25923活性.制备HMGN2多克隆抗体,应用免疫荧光化学、酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹方法对HMGN2进行定位分析,证明单个核细胞经IL-2刺激成为LAK细胞时部分HMGN2由胞核转移至胞浆,进而分泌到胞外.提示HMGN2是LAK细胞一个新的免疫效应分子.

赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达

目的分析赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22的结构特征,并对其进行克隆表达。方法分别以问号状赖型钩体017株、56601株及双曲状钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建Loa22基因与质粒pGEX-4T-1的重组原核表达质粒,克隆筛选并测序。利用Bioedit、Dnaman、PSIPRED、NCBI及SignaIP等对其结构进行分析。最后在大肠杆菌JM109中诱导表达目的蛋白。结果不同毒力赖型钩体均能扩增出约600bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pGEX-Loa22构建成功:分析显示不同赖型钩体的Loa22的同源性很高,C末端都具有同OmpA一致的保守序列及肽聚糖相关基序,都有信号肽序列;表达产物经SDS-PAGE检测证明是目的蛋白。结论赖型钩体具有编码OmpA膜蛋白的Loa22基因,可能与赖型钩体毒力和免疫原性存在某种相关性。

四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制 ,探索四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因突变特征。方法 采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度 (MIC) ,再通过聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR- SSCP)和直接测序检测结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物临床分离株 gyr A耐药决定区 (QRDR)突变 ,并和标准株 H 37Rv比较。结果 6 8株临床分离株中 ,14株喹诺酮药物敏感株和 8株低耐药株未发现 gyr A耐药决定区基因突变 ,2 5株高耐药株、11株低耐药株和 10株药物敏感株检测到 gyr A基因突变 ,高耐药株突变率为 10 0 % ,低耐药株突变率为 5 8% ,敏感株突变率为 4 2 % ,总的突变率为 6 8%。根据 SSCP条带 ,gyr A突变可分成 4种类型 ,测序发现分别为 Ser95 Thr、Asp94 Gly、Ala90 Val、Ala83Val突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与 gyr A基因突变密切相关 ,gyr A基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。

人IL-12与结核分枝杆菌抗原ESAT-6联合基因疫苗的免疫效果观察

人白细胞介素12（IL-12）与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察.近交系BALB/c小鼠,随机分组：A组（生理盐水对照）、B组（pcDNA3.1空质粒对照）、C组（BCG对照）、D组（pcESAT-6）和E组（pcIL-12＋pcESAT-6）.B、D、E质粒免疫组小鼠分别于胫前肌肌肉注射布比卡因（7.5g/L）和质粒的混和物（1：4,100μL,含质粒70μg/次）,A组小鼠肌肉注射生理盐水和布比卡因的混和物（1：4,100μL）,均间隔2周免疫一次,共免疫3次;末次免疫时,C组小鼠皮下注射BCG菌液,0.3mL/只,含10^6CFU/mL.末次免疫后14d和28d,各组小鼠分别取血分离血清用于总IgG测定,同时分离脾细胞,经TB-PPD刺激后检测脾细胞增殖（XTT比色法）活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）、白介素4（IL-4）分泌水平.pcESAT-6质粒DNA单独免疫（D组）或与pcIL-12质粒DNA联合免疫（E组）,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且抗体水平在末次加强免疫后14～28d逐渐增加;但pcIL-12与pcESAT-6联合免疫后,特异性抗体水平较pcESAT-6单独免疫增加不明显（P＜0.05）.c、D、E组免疫小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,E组小鼠特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平明显强于C组和D组（P＜0.05）,而IL-4分泌水平相互间未发现明显差异.末次加强免疫后14～28d,E组小鼠脾细胞增殖活性维持在较高水平,而C组小鼠脾细胞增殖活性先低后高,D组则先高后低;IFN-γ诱生水平,E组最高,C组次之,D组最低.pcIL-12与pcESAT-6质粒DNA联合免疫后能刺激机体产生强烈的细胞免疫和稳定的体液免疫,在动物体内诱发的细胞免疫较ESAT-6或BCG单独免疫时均有明显增加并维持较长时间,此外联合免疫后诱导的体液免疫也较BCG免疫有明显增加.

转基因和基因治疗

一、概念 基因治疗就是以正常或野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中,以替代或置换致病基因。从而产新的表型的一种治疗方法。基因治疗必需具备目的基因.靶细胞以及将目的基因导入靶细胞的转基因方法,同时目的基因的表达以及对此表达的调控也是基因治疗必不可少的重要条件。

分子生物技术在钩端螺旋体病研究进展

钩端螺旋体病(简称钩体病)是严重危害农业人口和农业动物的人兽共患病,遍及世界五大洲。中国是一个钩体病多发国家,流行区和感染面广,对农业的影响十分突出。本病常年散发不断,常常发生局部流行。倘遇较大自然灾害(如洪水),本病流行甚至暴发流行的危险即成倍增加,重症钩体病(如肺弥漫性出血型)可导致病人迅速死亡。我校钩体病研究室及国内同行对钩体病的防治进行了长期深入地研究和实践,取得若干重大成果,然而,钩体病防治仍存在一系列急待解决的问题。

国际钩端螺旋体分子生物学研究的进展和趋势

1981年Marshall运用限制性内切酶分析(REA)研究了钩体基因组DNA,开创了钩体现代分子研究的新纪元。Robinson、Thierman等人相继利用REA发现钩体菌株间用传统血清学方法不能证实的差别,认为REA具有精确和可靠的特点。1987年Hookly利用电子计算机大量比较了钩体内切酶带型,Yasnda则根据ONA的相关性将钩体分为12个基因组。该分类较经典方法更能体现钩体本质属性,得到国际广泛认可。

赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因结构比较性研究

用 PCR方法扩增不同毒力赖型钩体 Omp L1基因片段 ,进行序列测定 ,用相关软件比较分析核苷酸序列、蛋白质二级结构以及限制性内切酶谱 .不同毒力赖型钩体均能扩增出960 bp的片段 ,非致病 Patoc株未能扩出相应片段 ,中国赖型参考株 Omp L1序列 ( Gene BankNo.AF2 50 31 8)与流感伤寒型相应序列比较有 98个核苷酸差异 ,同源性为 89.8% ,二级结构预测和氨基酸疏水图显示变异主要发生在跨膜蛋白的膜外区 ,其膜上成分并未明显变化 ;赖型强弱毒力株之间 Omp L1序列仅 8个核苷酸差异 ,6个氨基酸变异 ,且集中在 C末端 2 92 -30 5位氨基酸之间 ;限制性内切酶谱分析显示赖型 Omp L1基因位点发生特异变化 .结果提示 ,外膜蛋白 Omp L1基因是钩体保守性较强的致病标记 ;赖型钩体减毒致弱可能与 Omp

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P<0.05)。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的 克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( +)中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果 重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论 结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性。