竞争性RT-PCR测定法及BMP-2mRNA的定量检测

建立竞争性 PCR方法 ,以期用于转录水平基因表达的定量研究 .以检测大鼠颅骨骨细胞总RNA中骨形态发生蛋白 - 2 ( BMP- 2 ,bone morphogenetic protein- 2 ) m RNA含量为例 ,构建大鼠BMP- 2基因的竞争模板 ,以之为内对照进行竞争性 PCR.PCR反应结束后 ,电泳、拍照 ,扫描所扩增条带密度 ,作回归方程 .根据回归方程 ,计算出正常 7d Wistar大鼠颅骨总 RNA中 BMP- 2 m RNA含量为 1 .1 2 5amol/μg RNA.结果显示 ,成功构建了大鼠 BMP- 2基因的竞争模板 ,建立了可以测定大鼠颅骨骨细胞总 RNA中 BMP- 2 m RNA含量的竞争性 PCR方法 .

糖尿病大鼠瘦素受体OB-Ra表达的研究

目的 探讨瘦素受体OB RamRNA在糖尿病 (DM)大鼠多个组织中的表达及胰岛素(Ins)分泌减少对其表达的影响。 方法 从大鼠脾组织中提取总RNA ,采用逆转录PCR技术扩增了约 1.4 4kb的OB Ra基因片段 ;以四氧嘧啶诱导DM模型大鼠 ;检测和比较正常和DM大鼠多个组织中OB RamRNA的表达。 结果 OB RamRNA在大鼠体内广泛表达 ,脾、睾丸、腹部白色脂肪(简称脂肪 )及大脑等组织中表达水平较高 ,而心、肺中几乎未见表达 ;DM大鼠的胰腺、脂肪和睾丸等组织OB RamRNA的表达量与正常大鼠相比 ,分别减少了 6 2 %、15 %和 11%。 结论 DM大鼠体内胰腺、脂肪和睾丸等组织中OB

人骨形态发生蛋白-2基因的真核表达载体构建

目的:利用杆状病毒载体,构建可直接转染昆虫细胞Sf9的含人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因的重组穿梭载体(bacmid DNA),最终获得重组蛋白。方法:将编码包含hBMP-2 N-端信号肽,中间前肽以及C-端成熟肽共1188bp的cDNA片断,插入真核表达载体pFastBacl的多克隆位点,受控于pPolh启动子,构建成pFastBael/hBMP-2重组转移载体。重组子转化大肠杆菌DH10Bac。转座后,挑选阳性菌落,提取bacmid DNA,经PCR鉴定后,以重组bacmid DNA转染Sf9细胞。收集重组病毒,扩大转染Sf9,表达产物行SDS-PAGE初步鉴定。结果:获得了含hBMP-2全长cDNA片段的重组bacmid DNA和重组病毒,经SDS-PAGE证实在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白,经激光密度扫描仪扫描显示分泌性蛋白表达量占细胞蛋白总量的35.6%。结论:利用杆状病毒载体成功构建了可用于直接转染昆虫细胞而无需同源重组的重组bacmid DNA,并在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白。

牦牛肾脏cDNA文库的构建

目的 :构建牦牛肾脏的cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆和表达有益基因做准备。方法 :从牦牛肾脏中提取总mRNA ,经逆转录合成cDNA后 ,以pSPORT1质粒为载体构建cDNA文库。结果 :牦牛肾脏cDNA文库库容量为1×106转化子/μgcDNA ,经E.coliDH5α菌株平板测定 ,重组率为93 %。结论 :经平板鉴定和PCR鉴定表明 ,所构建cDNA文库达到建库要求 。