肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中4-二甲氨基吡啶残留量高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的建立肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)含量检测的高效液相色谱(HPLC)法,并对该方法进行验证。方法通过对色谱柱类型、流动相组成的优化建立检测肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合疫苗中DMAP残留量的HPLC法,对该方法进行专属性、准确度、重复性和重现性验证,并确定检出限、定量限及线性范围。用建立的方法检测13种不同血清型的肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合疫苗及1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化肺炎球菌多糖中间产物中DMAP残留量。结果优化后的色谱条件:色谱柱为Sepax HP-C18(5μm,4.6 mm×250 mm);流动相为5 mmol/L庚烷磺酸钠溶液(含20 mmol/L磷酸二氢钾,磷酸调pH至3.0)∶乙腈=87∶13(V/V);检测波长为280 nm;流速为1 mL/min;进样体积为10μL;柱温为35℃。该方法不受供试品机制和前处理溶剂的干扰,专属性好;检出限和定量限分别为3.6和14.4 ng/mL,在0.05~10μg/mL范围内线性良好,R2=0.9999;加标回收率为83%~105%,重复性RSD为0.28%~0.72%,重现性RSD为7.38%。13种不同血清型肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合疫苗中DMAP残留量为0.135~1.635μg/mL;CDAP活化肺炎球菌多糖第一步中间产物即可检测出DMAP,未检测到CDAP。结论建立的HPLC法操作简便,专属性、准确度、重复性和重现性均较好,可作为肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗质量控制的有效检测方法。