副结核分枝杆菌免疫原蛋白的筛选及免疫保护效果评价

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失,并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善,现有的PTB疫苗保护效果不佳,并且干扰牛结核病的诊断,因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白,并对其免疫保护效果进行评价,为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因,分别构建5种重组质粒,在获得5种重组蛋白基础上,联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠,通过IFN-γELISPOT试验筛选出最佳免疫原;随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合,经皮下多点注射免疫小鼠,在二免3周后用1×10^(8)CFU的MAP K-10菌株腹腔感染小鼠。通过IFN-γELISPOT试验,抗体监测和细胞因子检测,分析感染后小鼠的体重、肝脏病理学和组织病理学变化及其荷菌数差异,综合评价候选亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护效果。【结果】以MAP p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c为基础成功构建和表达了5种融合蛋白58F、62F、69F、46F和52F,其中免疫58F后产生的IFN-γ水平最高,是更具潜力的候选免疫原,且以融合蛋白组合66NC+58F诱导持久高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a水平,诱导特异性的IFN-γ、TNF-α和IL-17A的释放;在保护效果评价中,融合蛋白组合66NC+58F抵抗MAP感染造成的体重下降,显著减轻肝脏的病理损伤,降低MAP在肝脏中的定植。【结论】融合蛋白组合66NC+58F诱导小鼠产生Th1和Th17型免疫反应,对MAP感染有着一定免疫保护作用,是PTB重要的候选亚单位疫苗。

翼齿六棱菊化学成分研究

目的：研究翼齿六棱菊Laggera pterodonta（DC.）Benth.的化学成分。方法：采用硅胶、ODS和Sephadex LH-20等色谱手段分离翼齿六棱菊乙醇提取物的化学成分;根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。结果：从翼齿六棱菊中分离得到10个化合物,分别鉴定为：3,4＇,5-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮（1）、3,3＇,5-三羟基-4＇,6,7-三甲氧基黄酮（2）、金腰带素B（3）、5-羟基-4＇,7-二甲氧基黄烷（4）、5,7,4＇-三羟基-3,3＇-二甲氧基黄酮（5）、洋艾素（6）、槲皮素（7）、乔松酮（8）、木犀草素（9）、芹菜素（10）。结论：其中,化合物1、2、4、5、8~10为首次从该植物中分离得到。

丁香及其丁香属植物的研究进展

对木犀科丁香属丁香及其同属植物从化学成分及其含量的测定方法以及药理作用三方面进行综合阐述.

菘蓝的染色体制片技术及核型研究

目的:建立板蓝根染色体制片技术及核型分析方法,以解决生产中品种混乱、品种鉴定的实际问题.方法:以菘蓝种子萌发后的根尖细胞为材料,用不同预处理方法制备染色体标本,选择一种较易制备理想的染色体标本的方法,并利用这些染色体标本对二倍体与四倍体染色体进行了核型分析.结果:确定了菘蓝染色体的制片方法,获得了二倍体、四倍体染色体图片,通过分析二倍体染色体数为14条,核型为公式为2n=2x=14=14m,四倍体染色体数为28条,核型公式为4n=4x=28=28m.

穿心莲内酯的超声波提取法研究

本实验以穿心莲茎杆粉末为原料,采用超声波震荡法来提取穿心莲内酯.方法:实验人员针对三个实验因素分别设计了三个实验水平,包括:(1)超声波振荡时间因素设计了20分钟、40分钟、80分钟、120分钟;(2)原料与溶剂体积比因素设计了1:5、1:10、1:15、1:20;(3)四种不同溶剂提取:水、75%乙醇、乙酸乙酯、石油醚.通过比色法测定提取液的光吸收值,并进行比较,选出最佳的提取方法.结论:实验结果表明最理想溶剂是75%乙醇,固体粉末与溶剂比为1:20,超声时间控制在40分钟的提取效果最佳.

蒲桃属丁香的研究进展

对桃金娘科蒲桃属丁香从化学成分及其含量的测定方法以及药理作用三方面进行综合阐述.药理作用主要有抗菌、抗氧化、抗癌等作用;含量测定方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、可见光及紫外分光光度法.本文对蒲桃属植物丁香进行了系统的文献检索和全面的综述.

浅谈生药学教学的传承与改革

本文通过对生药学的教学实践,从调动学生积极性,提高学生学习兴趣,重视实验,计算机辅助教学等几个方面,总结出一些教学方法,从而提高了生药学的教学质量.

结核分枝杆菌PE26蛋白调节巨噬细胞免疫反应进而促进分枝杆菌胞内定殖

结核分枝杆菌(MTB)PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-PE26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p AIN-PE26/Ms,经western blot鉴定结果显示,p AIN-PE26/Ms正确表达重组PE26蛋白(rPE26)。利用差速离心分离p AIN-PE26/Ms亚细胞组分,经western blot鉴定结果显示,r PE26定位于p AIN-PE26/Ms细胞壁。通过p AIN-PE26/Ms的菌落形态观察和生长曲线测定,结果显示,p AIN-PE26/Ms菌体表面较p AIN/Ms对照组更粗糙,脊不规则且相对较高,褶皱不明显;p AIN-PE26/Ms生长速度较对照组极显著增加(P<0.001)。利用H37Ra感染巨噬细胞,通过q RT-PCR检测pe26转录水平,结果显示,H37Ra感染巨噬细胞后pe26转录水平极显著增加(P<0.001)。利用p AIN-PE26/Ms感染巨噬细胞,分别通过q RT-PCR、ELISA检测细胞因子转录和表达水平,采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验、流式细胞术和胞内定殖的方法检测细胞毒性,结果显示,p AIN-PE26/Ms促进宿主细胞炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α)的转录和表达(P<0.05);r PE26促进巨噬细胞死亡,且在感染48 h时促进细胞早期凋亡(P<0.05);r PE26促进p AIN-PE26/Ms在巨噬细胞内的定殖(P<0.01)。上述结果首次表明,定位于细胞壁的r PE26在感染巨噬细胞过程中促进p AIN-PE26/Ms的生长、炎性细胞因子的转录和表达、巨噬细胞凋亡和胞内定殖。本实验为解析PE26参与分枝杆菌的致病机制和MTB调节宿主免疫反应的机制提供一定参考依据。

副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP_2739的酶学特性研究

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板,PCR扩增获得map_2739目的基因约891 bp,克隆于表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b-map_2739,转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果,并通过western blot鉴定。结果显示,获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP_2739蛋白(rMAP_2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体,通过ELISA方法检测,多抗血清效价为1∶51200。经差速离心法分离MAP参考株组分,利用该多克隆抗体为一抗,通过western blot检测,结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带,表明MAP_2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定,结果显示MAP_2739蛋白为脂肪酶,可水解短链和长链脂肪酸,其最适酶反应pH值为9.0,且rMAP_2739蛋白经巴氏消毒法预处理后,仍具有脂肪酶活性。以重组质粒pET-22b-map_2739为模板,利用各定点突变引物,经PCR扩增各突变的map_2739基因,并测序后转化大肠杆菌感受态细胞,通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况,并进行了酶活测定分析,结果显示获得各定点突变纯化蛋白,确定S46和D204为MAP_2739的酶活性位点。综上所述,本研究首次证明MAP_2739是MAP胞外GDSL脂肪酶,该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础。

结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×10^(3)cfu/mL~1.0×10^(0)cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0 cfu/mL~10.0 cfu/mL。将浓度为1.0×10^(6)cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5 d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果。结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1%(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5%(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8%(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0%(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0%(114/114)。本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的Taq Man多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

耐热氨纶的研究现状

介绍了氨纶的生产现状;对比分析了干法纺丝、熔融纺丝、湿法纺丝和化学反应法的氨纶生产方法;阐述了聚氨酯脲和聚氨酯弹性体耐热性的改进原理和方法;详述了通过聚氨酯软段及硬段、扩链剂、交联剂、添加剂、熔融纺丝等手段改进氨纶耐热性的研究进展;指出使用合适的添加剂和扩链剂或多种改性方法综合运用将是今后提高氨纶的耐热性的主要方向。

借助多媒体技术 加强寄生虫学教学效果

本文介绍了在寄生虫学教学和实验中运用多媒体现代教育技术,改进教学方法,优化教学环境以提高教学质量的体会.

t-丁醇冷冻干燥法在植物扫描电镜样品制备中的应用

试用t—丁醇(第三丁醇)冷冻干燥法对扫描电镜植物样品进行干燥处理。通过扫描电镜观察,图象没有重大的干燥人工损伤,放大倍数优于或等同于临界点干燥法所得到的放大率。

巨噬细胞炎性蛋白-1α促进急性髓细胞白血病细胞生长

背景:巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)是趋化因子CCL家族中的一员,主要参与炎性反应中中性粒细胞的渗出,同时在许多恶性血液肿瘤中扮演着危险因素的角色。目的:探讨MIP-1α对AML细胞增殖的影响。方法:以MLL-AF9诱导的小鼠急性髓细胞白血病(AML)为模型,流式细胞术检测小鼠白血病发病进程及白血病干细胞比例变化;实时定量荧光PCR技术检测AML小鼠全骨髓和全脾脏细胞中MIP-1α基因的表达水平;采用集落形成实验(CFC)和体外培养AML细胞并进行细胞计数的方法检测AML细胞的增殖能力;应用小分子拮抗剂从治疗角度干预MIP-1α与其受体CCR1作用,检测阻断MIP-1α作用后对AML增殖及致病力的影响。结果:MIP-1α可以促进AML细胞增殖和集落形成,阻断MIP-1α作用可抑制AML细胞增殖并延缓AML发病。结论:MIP-1α对于AML的发生发展具有促进作用,可作为AML潜在的治疗靶点。

准噶尔盆地西北缘南斜坡区八道湾组沉积相研究

西北缘南斜坡区八道湾组沉积相类型和展布认识较少,需进一步深化。笔者通过对研究区钻井、测井、岩心等资料分析,八道湾组岩性以砂砾岩为主,沉积具砂泥互层及夹杂煤线特征。八道湾组可识别出扇三角洲相、辫状河流相、辫状河三角洲相及湖泊相,八_5砂层组沉积期湖平面较低,物源供应充足,研究区广泛发育扇三角洲相;八_4砂层组沉积期湖平面依然较低,研究区以辫状河及辫状河三角洲相为主;八_3砂层组为湖平面上升期,发育滨浅湖相;八_2至八_1砂层组为湖平面下降期,以辫状河三角洲相为主。