致病性弧菌检测新技术研究进展

随着人们对水产品需求的增加及致病性弧菌引发的食源性疾病的流行,致病性弧菌对水产养殖业及人类健康造成了巨大威胁,基于此,致病性弧菌检测新技术的开发变得尤为迫切。本文介绍了包括免疫学方法、核酸检测方法、基于生物芯片的检测方法、基于核酸适配体的检测方法、基于肽质量指纹图谱技术的检测方法、基于生物传感器技术的检测方法在内的6项检测技术,分析了其优缺点及其在致病性弧菌中的应用。最后,总结了致病性弧菌检测新技术的研究现状,结合新兴技术指出未来研究方向,为致病性弧菌的快速检测提供参考。

变性高效液相色谱检测霍乱弧菌

变性高效液相色谱(DHPLC)是近几年刚发展起来的一种快速检测PCR扩增产物的新技术.应用该技术快速检测O1、O139、非O1、非O139群霍乱弧菌的外膜蛋白基因(ompW).根据霍乱弧菌外膜蛋白基因的特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC进行快速检测.以54株参考菌株做特异性检测.在丹东口岸国境外环境水体采集水样310份,以PCR-DHPLC和常规分离培养进行了比较,对丹东口岸国境外环境水体霍乱弧菌感染状况进行了检测,并对分离株进行了ompW基因测序.试验结果表明该方法有很好的特异性,310份水样中经PCR-DHPLC检测出58株霍乱弧菌的分菌株,阳性率为19%,与常规分离培养比较,符合率为100%.分离株的ompW序列与Genbank中的存在1%～3%的差异.这种检验方法特异性强,简便快捷,为霍乱防治提供了一种有效的检测新手段.

小浆果中食源性甲型肝炎病毒和诺如病毒流行状况及检测方法的研究进展

小浆果是食源性甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)和诺如病毒(norovirus,NoV)感染爆发的重要传播载体,受到全世界的广泛关注。为及时了解小浆果产品的病毒污染情况,需要对不同类型小浆果中的食源性病毒进行准确检测。由于受污染的小浆果携带病毒含量较低,且自身质地脆弱并含有大量果胶、多酚、多糖、色素等反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)抑制物,容易产生大量的"假阴性"结果,给食源性病毒的监测带来困难。在广泛查阅文献的基础上,本文综述了HAV和NoV在小浆果中的流行状况,指出了小浆果中食源性病毒检测的改进方向,阐述了全程过程控制、分子过程控制和RT-PCR过程控制在食源性HAV和NoV检测中的应用情况,为加强HAV和NoV在小浆果中的防控能力提供方法学参考。

食品中甲型肝炎病毒RNA提取方法的比较及应用

目的:对食品中甲型肝炎病毒的3种RNA提取方法进行综合比较,以优选出最佳的核酸提取方法,为各级实验室开展食源性甲型肝炎病毒核酸检验提供技术参考。方法:分别采用ABI AM1836、QIAGEN 74104和ROCHE11858882001三种商业化核酸提取试剂盒对人工污染甲型肝炎病毒的食品样品进行核酸提取,根据3种核酸提取方法的提取效率、抑制剂去除效率、检测灵敏度、综合应用指标进行病毒RNA的优化,且采用优化后的提取方法进行实际样品的检测。结果:综合病毒各项评价指标显示,ROCHE 11858882001在食品中提取甲型肝炎病毒RNA效果最优,其次为QIAGEN 74104和ABI AM1836。101份样品的检测结果显示,一份蓝靛果样品为甲型肝炎病毒核酸阳性,其余样品均为阴性。结论:ROCHE 11858882001是一种快捷有效的病毒RNA提取方法,适用于食品中甲型肝炎病毒的日常检测工作。

实时荧光PCR快速检测食品中致敏原芹菜成分

探讨采用实时荧光PCR技术建立检测食品中致敏原芹菜成分的方法。试验结果表明:针对芹菜管家基因Mtd基因设计的特异性检测引物和探针进行检测时,31种样品经实时PCR扩增,只有芹菜和西芹样品产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号。灵敏度试验结果表明:该方法对芹菜致敏原基因的检测灵敏度较高,可检测到芹菜过敏原样品中10mg/kg～1mg/kg的含量。

养殖河豚鱼的海洋尾丝虫病病例

2007年,辽宁丹东河豚鱼养殖场时常发生一种由盾纤毛虫感染导致的寄生虫病,造成河豚不同程度的死亡,而且该病每年反复发作,给该产业带来一定的经济损失,本文介绍了对该寄生虫的分离培养和鉴定结果[1-2]。

实时荧光PCR法检测食品中芝麻过敏原成分

本实验探讨采用实时荧光定量PCR方法检测食品中的芝麻成分,结果表明:采用芝麻的引物和探针进行扩增时;22种样品经实时PCR扩增,只有白芝麻和黑芝麻产生荧光信号,其余样品均不产生荧光信号。灵敏度实验结果表明能检测到10-5稀释度的4.4×10-12gDNA的量,定量关系式为:y=-3.472018x+18.851009,R2=0.993088。这两对引物和探针具有极高的灵敏度和扩增效率,符合痕量检测要求。

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)是近年来国内外学者公认的新食源性致病菌,对全球公共卫生和食品安全造成潜在威胁。本研究根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计了普通PCR引物和实时荧光PCR引物、探针,建立了用于弗尼斯弧菌快速检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法,对这2种方法的特异性和灵敏度进行比较分析。研究表明,建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,2种方法的检测灵敏度分别是传统培养方法的10和1 000倍,同时对384份水产品和食品样品进行检测,共检出6株阳性菌株。本研究建立的基于弗尼斯弧菌toxs基因的2种PCR方法特异性均为100%,灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,完全满足了弗尼斯弧菌的检测标准,可应用于食品样品中弗尼斯弧菌的检测。

红发夫酵母原生质体的形成和再生

研究了用NOVOZYME234酶,制备红发夫酵母的原生质体和再生的条件。

养殖河豚鱼弧菌病原菌的鉴定和生物学特性分析

从鳍基部、躯干部以及腹面出现斑点状出血的患病河豚鱼病灶处分离出11株优势菌(M1～M11),以体壁肌肉注射方式进行感染实验,证实菌株M2、M3～M6和M10为养殖河豚鱼鳍基部、躯干部以及腹面出现斑点状出血的病原菌,经形态学观察、生理生化特性分析和实时PCR检测,鉴定结果均为河弧菌。对15种药物的敏感性试验证实该菌株对氯霉素、环丙沙星和诺氟沙星较为敏感。

Taqman MGB PCR定量检测水产品中沙门氏菌的方法建立

建立采用Taqman MGB实时荧光PCR法快速定量检测水产品中沙门氏菌。根据沙门氏菌fimY基因保守序列,设计引物和Taqman MGB探针,建立Taqman MGB实时PCR定量检测体系。采用本方法对24株共14种血清型沙门氏菌和17株与沙门氏菌亲缘关系比较近,以及在样品中能同时存在的常见食源性致病菌菌株进行PCR扩增。结果显示:所有的沙门氏菌菌株结果均为阳性,而非沙门氏菌菌株检测结果均为阴性,反应特异性为100%。本方法的纯菌最低检测低限为13CFU/ml,样品江瑶贝和蚬子肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为130CFU/ml;香螺肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为1300CFU/ml。定量关系式为y=-3.381418lnx+45.115715,R2=0.964878。整个实验2h即可完成,可应用于水产品中沙门氏菌污染状况调查及快速检测。

三重实时荧光PCR检测纯培养物和环境水体中霍乱弧菌方法的建立及应用

本研究建立了检测O1群、O139群、非O1和非O139群霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的三重实时荧光PCR方法,并进行纯培养物和环境水体标本的检测评价。根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列和霍乱弧菌种特异的溶血素编码基因hlyA序列设计引物和探针,利用荧光标记物,建立同时检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1和非O139群的三重实时荧光PCR方法,对所建立的方法分别进行了灵敏度和特异性评价,同时与传统培养法进行了比较。研究建立的方法能特异扩增出O1群、O139群、非O1和非O139群霍乱弧菌;而对其它8种弧菌没有扩增;实时荧光PCR检测252份环境水体标本的增菌液,与常规分离方法相比显示了较高灵敏度,所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。本研究可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查和纯培养物的确认。

化学发光微粒子免疫检测法和实时荧光RT-PCR法检测甲型肝炎病毒的比较分析

目的:比较化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)和实时荧光RT-PCR法对218份人血清中甲型肝炎病毒的检测结果.方法:选取2016年8月~2016年11月辽宁省丹东市传染病医院住院患者的血清样本218份,采用CMIA法和实时荧光RT-PCR法检测甲型肝炎病毒,同时对采用实时荧光RT-PCR法的ISO/TS15216-2、FDA-BAM、GB/T 22287-2008三个标准检测甲型肝炎病毒的引物和探针组合进行了比较分析.结果:化学发光微粒子免疫检测法的阳性检出例数为3例,其S/CO值分别为2.22、4.15、1.31.ISO/TS 15216-2、FDA-BAM、GB/T 22287-2008三种实时荧光RT-PCR法的阳性检出例数分别为7例、5例和4例.而CM IA法和实时荧光RT-PCR法有2个阳性样本的检测结果一致,测序的BLAST比对结果表明CM IA法1个阳性样本为假阳性结果,5个CMIA法阴性样本为假阴性结果.结论:ISO方法的实时荧光RT-PCR法用于人血清中甲型肝炎病毒的检测,准确度及灵敏度最佳.

贝类中甲肝病毒提取方法的比较

目的对贝类甲肝病毒的3种试剂盒提取方法进行比较。方法在贝类样品中添加不同滴度的甲肝减毒疫苗后,采用3种核酸提取法:Roche法、AM1836法、Qiagen74104法。按照其说明书提取模拟样品病毒核酸模板,从抽提效率、抽提核酸的稳定性、抑制剂去除效率3个方面对提取效果进行比较。结果在抽提核酸稳定性、抑制剂去除效率方面,3种方法结果相同,稳定性的Ct值为24.795~28.651,抑制剂去除效率方面提取的核酸10倍稀释核酸Ct值比未稀释核酸Ct值差值均为2.9~3.2左右(F=26.802,P<0.05);在提取效率方面,Roche法高于AM1836法和Qiagen74104法,Ct值分别为28.5,28.7和29.0。结论3种方法中,Roche法在贝类中甲肝病毒提取方面更有优势,可以提高贝类中甲肝病毒检测的灵敏度。

丹东口岸2003-2005年进口海产品中3种致病菌的检验

目的掌握丹东口岸进口海产品中单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和副溶血性弧菌污染情况。方法对丹东口岸2003-2005年进口的海产品3种致病菌的检验结果进行了分析。结果1965批进口海产品中检出不合格产品44批(2.24%)。其中32批(1.63%)检出单核细胞增生李斯特菌、6批(0.31%)检出沙门菌和6批(0.31%)检出副溶血性弧菌。不合格产品主要为冻章鱼、冻海螺、冻紫石房蛤、活河螺、冻河螺肉等。结论从丹东口岸进口的海产品3种致病菌的污染比较严重,特别是被单核细胞增生李斯特菌的污染最严重,海产品中冻章鱼和冻海螺被这3种致病菌的污染比较普遍。

基于DNA条形码技术对朝鲜牛黄安宫丸中犀牛角成分鉴别的研究

目的建立DNA条形码技术对朝鲜牛黄安宫丸中犀牛角成分的真伪鉴别方法,对打击非法贸易及保护珍稀濒危野生动物具有重大意义.方法以涉案朝鲜牛黄安宫丸为材料,根据材料自身的特点对其进行消化处理后采用市售动物基因组核酸提取试剂盒方法提取核酸,并采用DNA条形码片段12S rRNA通用引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增反应和测序.结果对测序结果使用NCBI中Blast进行序列相似性分析比对,结果表明5份涉案朝鲜牛黄安宫丸的扩增产物序列与非洲水牛的线粒体DNA的12S rRNA基因序列的部分片段的一致性达98.84%,因此为水牛角成分并非使用濒危物种犀牛角.结论依靠分子生物学中DNA条形码技术对疑似犀牛角药材进行准确的物种鉴定,可用于鉴别犀牛角药材的真伪,为各执法部门提供可靠的技术支持,规范国内和口岸犀牛角制品市场.

O1型霍乱弧菌Fosmid文库的构建及分析

为构建O1型霍乱弧菌Fosmid文库并对文库进行分析,采用低熔点琼脂糖包埋法提取O1群霍乱弧菌N16961完整基因组,用随机剪切法将基因组进行片段化处理,脉冲电泳分离片段化DNA并切胶回收33～48kb之间的DNA片段,然后对DNA片段进行末端平滑化和磷酸化处理,与pCC1FOS载体连接,经包装、转染后构建霍乱弧菌Fosmid文库。平均插入片段为37kb,共保存9 600个克隆,空载率小于2%。本文库符合文库的构建要求,文库的建立为O1霍乱弧菌重要基因及其功能的研究奠定了基础。

丹东口岸进口冷冻水产品中单核细胞增生性李斯特菌的分析

目的了解丹东口岸进口冷冻水产品中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况。方法对2005-2006年经丹东口岸进口的1060批冷冻水产品,采用mini-VIDAS快速筛选和BBLCrystal系统鉴定。结果共检出11批阳性样品,阳性率为1.04%,经血清凝集试验,8株是1/2a,2株是4b,1株是4e。结论丹东口岸进口冷冻水产品中单核细胞增生性李斯特菌污染比较严重,应引起有关部门的重视,加强监测。

酶联免疫吸附试验法检测盐渍鳀鱼中的组胺

通过用酶联免疫吸附法(ELISA)与紫外分光光度法检测盐渍鳀鱼中组胺含量结果的比较,表明2种方法检测的结果吻合,而且ELISA法更适合于检测组胺含量低的样品。

热浸提法酿造树莓酒的初步研究

本文采用热浸提法对树莓酒的酿造工艺进行了初步研究,通过测定发酵过程中的温度和糖度变化曲线,结果表明:树莓酒的前发酵期为5～6d;树莓汁在发酵过程中其糖度下降的最低点为5%左右,与一般果品存在着很大差异;明胶单宁澄清法既能提高效益,又能保证一定的品质;最后还对成品酒进行了质量评定。这为树莓酒的进一步研究提供了一定的科学依据。