膜通道研究再获诺贝尔奖

2003年的诺贝尔化学奖再次垂青膜通道领域的研究成果:Peter Agre因发现第一个细胞膜水通道蛋白,Roderick Mackinnon则因离子通道三维结构与功能机制方面的突破性成就而共同获奖.他们的研究成果为认识水和离子通过细胞膜的机制奠定了坚实的基础,同时开启了若干全新的生物医学研究领域.

水通道AQP1敲除小鼠肿瘤血管生成障碍及肿瘤生长减缓

血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的必要步骤. 肿瘤血管生成涉及瘤旁组织血管内皮细胞增殖、向肿瘤细胞团内迁移以及管腔形成,目前机理尚不完全清楚. 水通道AQP1在多种肿瘤血管内皮高表达,提示其可能参与肿瘤血管的生成过程. 应用AQP1敲除小鼠荷瘤实验证实了AQP1在黑色素瘤生长和血管新生中的作用. 结果表明,皮下接种的黑色素瘤在AQP1敲除小鼠的生长较之在野生型小鼠延迟近30%(P< 0.01). 免疫组化与肿瘤病理形态学分析显示,AQP1在野生型小鼠黑色素瘤血管内皮细胞上高表达,而在AQP1敲除小鼠黑色素瘤血管内皮细胞呈阴性表达. 在病理结构上,黑色素瘤细胞围绕血管分支呈岛状分布. 野生型小鼠黑色素瘤内血管管腔较细小,而AQP1(-/-)小鼠黑色素瘤内血管床显著膨大. AQP1(-/-)小鼠肿瘤内平均微血管密度(47/mm2) 较之AQP1(+/+)肿瘤(142/mm2) 减少67%(P< 0.01). 围绕AQP1(-/-)肿瘤血管的肿瘤细胞岛周边坏死区域明显大于AQP1(+/+)肿瘤. 上述结果提出确切证据表明,AQP1缺失使肿瘤血管生成发生障碍,从而影响了肿瘤血液供应和肿瘤生长. AQP1参与肿瘤血管生成的机理值得深入研究.

20(S)-原人参二醇促进CFTR氯离子通道开放

利用氯离子通道细胞荧光测定模型对386种中药单体化合物进行筛选,发现20(S)-原人参二醇对依赖于cAMP的CFTR氯离子通道具有激活作用.20(S)-原人参二醇能够以剂量依赖的方式激活野生型CFTR氯离子通道,其激活作用通过更为可靠的氯离子通道短路电流测定系统得到证实.20(S)-原人参二醇对CFTR氯离子通道的激活效应具有作用迅速且可逆的特点.其在发挥激活作用时依赖于腺苷环化酶激动剂Forskolin的存在,单独与细胞孵育不提高细胞内cAMP的水平,表明对CFTR氯离子通道的激活作用是通过与CFTR直接结合实现的.该化合物对ΔF508-CFTR突变氯离子通道的开放也具有特征相似的激活作用.

TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法

将人酸性纤维母细胞生长因子’（ａＦＧＦ’）ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物以ＴＡ连接方式克隆入ｐＣＲ￣（ＴＭ）ＩＩ质粒，然后采用Ｔ７和Ｓｐ６启动子特异性引物对克隆的片段以双脱氧未端终止法进行双链ＤＮＡ测序。

水通道蛋白的生理功能——水通道基因敲除小鼠表型研究进展

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一族细胞膜上选择性高效转运水分子的特异孔道.自从Agre等于1992年从红细胞膜发现第一个水通道蛋白AQP1以来,有关水通道蛋白结构与功能的研究取得了迅速的、系列性的进展.已报道的哺乳动物AQP家族已有11个在蛋白质序列上有同源性成员(AQP0～AQP10).AQP在体内各系统组织中广泛表达,除了在与体液分泌和吸收密切相关的多种上皮和内皮细胞高表达外,在一些与体液转运无明显关系的组织细胞如红细胞、白细胞、脂肪细胞和骨骼肌细胞等处也有表达,提示AQP可能在多种器官生理和病理中发挥重要作用.基因打靶技术是研究特定基因在体内生理功能的有力手段.目前AQP1、3、4、5基因敲除和AQP2基因点突变的基因敲入小鼠模型(模拟人类常染色体隐性遗传尿崩症)已成功建立并广泛用于表型研究,在AQP水通道蛋白生理功能方面获得许多重要进展.

细胞运动中的水通道蛋白——细胞迁移及相关生理和病理机制的新视点

细胞迁移(cellmigration)在机体生命活动中的胚胎发育、免疫防御、损伤修复、血管新生以及肿瘤转移等许多重要生理和病理过程中发挥核心作用.越来越多的证据表明,细胞迁移中处于极性分布的细胞膜离子通道和离子转运体可以通过调节细胞体积变化协助细胞的移动.然而细胞膜水转运机制在这一过程中的作用尚未阐明.Saadoun等2005年4月发表于《自然》杂志上的一项研究发现细胞膜水通道蛋白在细胞迁移中发挥重要作用.为细胞迁移的分子机制增加了新的内容,也为水通道基因功能研究开启了一个新的领域.

角质细胞生长因子的研究进展

角质细胞生长因子 (KGF)是成纤维细胞生长因子 (FGFs)家族的成员 ,即FGF - 7,最初是从人胚胎肺成纤维细胞的培养上清中分离纯化获得的。成熟KGF为一 16 3个氨基酸残基的单链多肽 ,分子量为 2 6— 2 8KD。KGF由各种来源的间质细胞分泌 ,受体分布于上皮细胞 ,其生物学活性是特异性地促进上皮细胞的增殖、迁移和分化。KGF的表达受激素和一些细胞因子的调控。有关研究表明 ,KGF对肺泡Ⅱ型细胞的增殖以及皮肤、胃肠道粘膜和角膜损伤的修复具有十分重要的作用。

胡椒碱对人肝癌HepG2细胞抗肿瘤活性的体外实验研究

目的探讨胡椒碱(piperine)对人HpeG2肝癌细胞株的增殖、杀伤和细胞凋亡的影响,为肝癌的治疗提供理论依据。方法体外培养的HpeG2细胞,采用MTT比色法检测不同浓度胡椒碱对体外培养的HepG2细胞和新分离的外周血白细胞的增殖抑制作用。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态,采用流式细胞术测定胡椒碱对HepG2细胞的凋亡。结果胡椒碱对HepG2细胞增殖的抑制率随着浓度的升高而增加,半量抑制浓度(IC50)为15.13±3.21μmol/L,低于其对外周血白细胞的抑制率(64.52±5.32μmol/L)。Hoechst 33258染色后,胡椒碱处理癌细胞组表现出典型的细胞凋亡特征,流式细胞仪检测20μmol/L的胡椒碱处理HepG2细胞24h后,细胞凋亡率由对照组的2.89%上升到了21.76%。结论胡椒碱具有抑制HepG2细胞增殖和诱导凋亡的抗肿瘤活性,有应用于肝癌治疗的潜在价值。

EDS对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的观察在不同剂量蜕皮甾酮(ecdysterone,EDS)作用下,体外培养的神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)增殖、分化情况。方法原代培养新生SD大鼠海马NSCs,经EDS处理后,传代细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑盐比色法观察神经干细胞增殖能力的变化,免疫荧光细胞染色技术、流式细胞术检测神经干细胞分化情况。结果与对照组相比,中低剂量组(50、100、200mg/L),对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的EDS(400mg/L及800mg/L)干预组则明显抑制了NSCs的增殖。在分化条件下,EDS200mg/L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,其余各组无统计学差异。结论EDS能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。

水通道蛋白1-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达(简报)

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是一类选择性高效转运水分子的细胞膜通道蛋白，广泛存在于原核和真核生物细胞的细胞膜上．主要介导自由水分子的被动跨膜转运．对保持细胞内外液环境的稳态平衡起着重要的作用。AQP1是第一个被发现鉴定的水通道蛋白．它是1988年Agre等从红细胞膜分离纯化Rh血型多肽时偶然发现的一个分子量为28KD的疏水性跨膜蛋白．称为形成通道整合膜蛋白28（CHIP28）。Agre因此获得了2003年的诺贝尔奖。水通道蛋白AQP1广泛地表达于红细胞、肾、眼、肺，脉络丛和血管内皮，在体液转运中发挥作用。

AQP1真核表达载体的构建及其在FRT细胞的表达

目的:构建小鼠AQP1基因真核表达质粒并观察其在FRT细胞中的表达。方法:采用RT-PCR方法从小鼠肾脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的AQP1基因,采用基因重组技术将AQP1的cDNA片段插入真核表达载体pCAGGS,构建小鼠AQP1的真核表达质粒,脂质体转染FRT细胞进行表达。结果:酶切和测序结果证实AQP1真核表达质粒构建成功,经脂质体转染FRT细胞后,免疫荧光检测证明AQP1蛋白在真核细胞中成功表达。结论:成功构建真核表达质粒pCAGGS-AQP1-myc,并在FRT细胞中得以表达。为进一步研究小鼠AQP1过表达时的功能及机制奠定了实验基础。

AQP4与先天性脑积水的相关性研究

目的研究AQP4在脑积水鼠中的遗传规律,探讨其在脑积水中的作用。方法随机选择未脑积水AQP4敲除雄鼠与AQP4敲除雌鼠交配,用其F1、F2、F3代建立遗传图谱,研究其遗传规律。提取大脑组织总RNA,制作基因芯片研究其在遗传中的作用。结果 AQP4基因敲除表型的是可遗传的且与性别无关,同时并非单基因遗传,且为常染色体遗传;小鼠全基因芯片表明在AQP4敲除的背景下脑积水表型的发生有其它遗传基因的参与。结论通过制作遗传图谱以及小鼠基因芯片,证明AQP4在先天性脑积水发病机制中有重要的作用。

红毛藻抗氧化肽的菠萝蛋白酶酶解制备工艺优化及其活性评价

以红毛藻(Bangia fuscopurpurea (Dillw.) Lyngb.)蛋白为原料,经菠萝蛋白酶水解制备抗氧化肽,为红毛藻的深加工提供理论依据.以酶解液对DPPH·的?清除率为响应值,考察酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶底比对酶解液抗氧化活性的影响.在单因素试验基础上,通过L_9(3~4)正交试验优化红毛藻抗氧化肽的酶解制备工艺,并以酶解产物对O_2~ˉ·的清除能力和还原力为指标评价酶解产物的抗氧化活性.结果表明,用菠萝蛋白酶酶解红毛藻蛋白制备抗氧化肽的最优工艺参数为:酶解温度45℃、酶解时间90 min、酶解pH7.5、酶底比1200U/g.在最优酶解工艺条件下,红毛藻蛋白的水解度达到(10.74±0.13)%,酶解液中多肽浓度为(6.98±0.07) mg/mL,酶解产物对DPPH·和O_2~ˉ·的半数清除浓度(IC_(50))值分别为(0.4403±0.0142) mg/mL和(4.2600±0.0180) mg/mL,且具备一定的还原力.

红毛藻抗氧化肽的酶解制备工艺优化及其活性评价

以红毛藻(Bangia fuscopurpurea Lyngb.)蛋白质为原料,采用木瓜蛋白酶酶解方法制备红毛藻抗氧化肽.以酶解产物对1,1-二苯基-2-苦味酰基自由基(DPPH?)清除率为指标,据单因素试验,采用正交试验设计优化酶解制备抗氧化肽工艺,并评价多肽的抗氧化活性.结果表明,木瓜蛋白酶酶解红毛藻蛋白制备多肽的最佳酶解工艺参数为:酶解温度50℃、酶解时间120 min、pH 6.0、酶底比为1250 U/g.在最佳酶解工艺条件下,红毛藻蛋白水解度为13.85%±0.29%,酶解产物对DPPH?清除率达到87.46%±0.76%.酶解产物具备一定的还原力,且对DPPH?和超氧阴离子自由基(O2-?)的半数清除浓度(IC50)分别为(0.4514±0.0033)mg/mL和(3.3612±0.0376)mg/mL.

菠萝液泡膜水通道蛋白基因AcTIP1-1的克隆、重组载体构建

以菠萝(Ananas comosus(Linn.)Merr.)果实为材料,通过RT-PCR分别扩增液泡膜水通道蛋白基因(AcTIP1-1)(GenBank登录号:XM_020238793.1)的开放阅读框(ORF)和编码区(CDS)序列,序列长度分别为753 bp和750 bp.将ORF序列亚克隆到载体pET32a(+)上,CDS序列被亚克隆到载体pSP64 Poly(A)上,构建成重组载体pET32a(+)-AcTIP1-1和pSP64 Poly(A)-AcTIP1-1.pET32a(+)-AcTIP1-1可为诱导表达并纯化融合蛋白制备抗体,pSP64 Poly(A)-AcTIP1-1可为制备含有Poly(A)+的AcTIP1-1转录子奠定基础.

菠萝质膜水通道蛋白基因AcPIP2-4的克隆、重组载体构建

本研究以菠萝(Ananas comosus (L.) Merrill)果实为材料提取总RNA并合成cDNA.根据菠萝质膜水通道蛋白基因(AcPIP2-4)序列(GenBank登录号:XM020240565.1)设计1对特异性引物,通过RT-PCR从果实cDNA中扩增AcPIP2-4的ORF序列,并将该序列亚克隆至原核表达载体pET32a(+).经酶切鉴定和序列分析,结果表明,原核表达重组载体pET32a(+)-AcPIP2-4构建成功.以重组载体pET32a(+)-AcPIP2-4质粒为模板,通过RT-PCR扩增AcPIP2-4的CDS序列,再将其亚克隆至载体pSP64 Poly(A)上.经酶切鉴定及序列分析,结果表明,重组载体pSP64 Poly(A)-AcPIP2-4构建成功.重组载体pET32a(+)-AcPIP2-4和pSP64 Poly(A)-AcPIP2-4的成功构建,为后续制备抗AcPIP2-4的抗体和AcPIP2-4 c的RNA,进而进行AcPIP2-4的组织表达和功能研究奠定基础.

水通道蛋白AQP1的表达促进SMMC-7221人肝癌细胞的迁移

肿瘤细胞的迁移是肿瘤侵润和转移的关键步骤.本研究发现水通道蛋白介导的细胞膜高水通透性促进肿瘤细胞迁移.对高转移性SMMC-7221人肝癌细胞系进行RT-PCR,免疫荧光和免疫印迹分析,发现水通道蛋白AQP1表达.进一步分析发现,SMMC-7221细胞系有细胞膜高水通透性(SMMC-7221hPf)和低水通透性(SMMC-7221lPf)的两个亚群,分别与细胞膜AQP1表达量相一致.SMMC-7221hPf细胞的穿孔迁移速率和平面迁移率均显著高于SMMC-7221lPf,而细胞的贴附和增殖能力没有显著差别.AQP1腺病毒感染SMMC-7221lPf细胞提高了AQP1表达量以及细胞膜水通透性和细胞迁移速率.上述结果显示,水通道蛋白AQP1介导的细胞膜高水通透性促进SMMC-7221人肝癌细胞的迁移,并且可能参与肿瘤的侵润和转移过程.

土木香内酯对K562/ADR细胞增殖的抑制作用及其机制探讨

目的 探讨土木香内酯对慢性髓性白血病耐药细胞株K562/ADR增殖的抑制作用及其机制.方法 选用不同浓度（0、1、2、4、6、8、10 μmol/L）土木香内酯处理K562/ADR细胞不同时间,用MTT法测定土木香内酯对K562/ADR细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测土木香内酯对K562/ADR细胞凋亡的影响,Westem blot检测凋亡相关蛋白的表达.结果 土木香内酯对K562/ADR细胞有明显的增殖抑制作用,且呈明显的时间-剂量依赖性,其作用24 h的半数有效抑制浓度（IC50）值约为4.7μtmol/L （P＜0.05）;流式细胞术检测结果显示,0、2.5、5、7.5 μmol/L土木香内酯处理24 h后细胞凋亡率分别为1.35％、16.91％、29.61％和46.26％,亦呈剂量依赖性（P＜0.05）;同时土木香内酯能够降低Bcl-2、BCR-ABL的表达,上调Bax、细胞色素C、活化的caspase-9、caspase-3和PARP的表达.结论 土木香内酯对K562/ADR细胞具有明显的增殖抑制作用,其作用可能是通过caspase依赖的线粒体途径诱导细胞凋亡实现的.

土木香内酯通过调节细胞周期相关蛋白的表达抑制慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562／ADR增殖

目的研究土木香内酯对慢性粒细胞白血病（CML）耐药细胞株K562／ADR增殖、周期分布以及周期相关蛋白的影响。方法选用0、1．0、2．0、4．0、6．0、8．0、10．0μmol／L土木香内酯作用K562／ADR细胞12、24、48h，四甲基偶氮唑蓝（MTr）比色法检测土木香内酯对K562／ADR细胞的增殖抑制率，流式细胞术检测土木香内酯对K562／ADR细胞周期分布的影响，Westernblot检测周期相关蛋白的表达。结果土木香内酯能够显著抑制K562／ADR细胞增殖，半数抑制浓度为5．0μmol／L。流式细胞术检测结果显示，不同浓度（0、2．5、5．0、7．5μmol／L）的土木香内酯能够使K562／ADR细胞周期阻滞在G2／M期，G2／M期细胞比例由（15．8±1．7）％分别提高到（21．0±2．4）％、（26．4±2．7）％、（30．1±3．9）％（P〈0．05）。土木香内酯能够明显降低CDKl、CyclinBl的表达，上调周期抑制蛋白p21的表达。此外，土木香内酯能够有效地抑制bcr-abl融合蛋白的表达水平。结论土木香内酯可能通过调节细胞周期相关蛋白的表达介导K562／ADR细胞G2／M期阻滞，抑制细胞的增殖。

NPA motif在水通道蛋白AQP1表达和转水功能中的重要性

水通道蛋白(AQP)序列中的两个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸序列(NPA motif)是水通道蛋白家族中高度保守的特征性序列,其晶体结构研究显示,两个NPA motifs位于通道中心的狭窄部位,直接参与水分子的结合和选择性通过.为了进一步研究两个NPA motifs在水通道蛋白结构、功能和生源学(biogenesis)方面的重要性,通过点突变方法分别获得单独缺失NPA1或NPA2 motif以及同时缺失两个NPA motifs的3种水通道AQP1基因突变型.将3种AQP1突变cDNA分别亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1,建立稳定转染3种AQP1基因突变型的CHO细胞系.AQP1免疫荧光分析显示,3种AQP1突变蛋白均能正常表达并定位于质膜,显示AQP1蛋白质表达和细胞内加工过程未受NPA motifs缺失的影响.分别对表达3种AQP1突变蛋白的CHO细胞进行质膜水通透性功能分析,并与表达野生型AQP1的CHO细胞进行比较,结果显示,缺失NPA1或NPA2引起AQP1转水功能下降49.6%和46.7%,而同时缺失两个NPA motifs的AQP1转水功能与野生型AQP1相似.上述结果显示,水通道AQP1中的NPA motifs在AQP1转水功能中发挥重要作用,但对于AQP1蛋白的表达、细胞内加工和通道基本结构的形成并不起关键作用.