苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC-823细胞形态的影响

目的:克隆苦瓜蛋白MAP30基因,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,初步研究MAP30蛋白对BGC-823细胞的影响。方法:应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和双酶切鉴定,再进行测序分析,并构建重组表达载体pET-28a-MAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用NTA-Ni2+树脂分离纯化所表达的MAP30融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳鉴定;纯化的蛋白作用于BGC-823细胞后通过光镜和电镜进行形态学观察。结果:成功扩增出MAP30基因为861bp,与基因库中公布的DQ643967同源性为100%,与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建pET-28a-MAP30原核表达重组质粒;通过NTA-Ni2+树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的大小约为30000的MAP30融合蛋白,与预测一致;蛋白作用细胞后,细胞形态有明显变化。结论:成功构建pET-28a-MAP30表达载体并获得原核表达的MAP30融合蛋白;重组MAP30蛋白能引起BGC-823细胞明显的形态学变化。

幽门螺杆菌Cag-PAI hp0523基因的克隆及功能预测

目的：明确幽门螺杆菌Cag-PAIhp0523基因的功能，探讨其在幽门螺杆菌致病中的作用。方法：设计引物，以幽门螺杆菌NCTC11637为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的片段；将其进行T-A克隆后，进行测序。将该基因序列与其他菌株做BLAST比对分析，并结合生物信息学数据库和软件，分析其序列特征和理化特性。结果：经酶切，测序分析表明，插入的基因片断为510 bp，与基因库公布的幽门螺杆菌26695及J99序列相比较，同源性高达94%；软件预测其编码的蛋白为169个氨基酸，其相对分子质量约为19.7 kDa，等电点约为9.53；基序分析表明，在33-165位氨基酸之间存在一个保守的SLT催化基序，可能是溶菌糖基转移酶；对其催化能力进行预测，结果表明，HP0523（33.7%）催化能力可能较T4溶菌酶（32.3%）和溶菌酶SLT70（28.6%）的活性高。结论：成功克隆了幽门螺杆菌Cag-PAI的hp0523基因，对其序列进行了深入分析，为进一步研究其功能，阐明幽门螺杆菌Cag-PAI的致病机制奠定了基础。

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备

目的：构建表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC 11637 IV型分泌系统cagM（HP0537）全长编码基因的原核表达载体,分析其抗原性并制备抗体。方法：应用PCR技术从H.pylori基因组扩增cagM基因片段,TA克隆后测序分析,并构建表达载体pET-28a（＋）-cagM,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及鉴定表达蛋白,表达蛋白以Ni2＋-NTA柱进行纯化,用软件分析其抗原性后,免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价。结果：测序结果表明cagM基因全长1 131 bp（基因库登录号为GU269568）,编码376个氨基酸,与基因库中已知菌株J99,26695和G27的氨基酸同源性为98%~99%;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明,在43 700处发现一条新生条带,Ni2＋-NTA柱纯化后为单一条带,软件分析表明其抗原性较强,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶1.6×105。结论：首次成功克隆并表达了H.pyloripNCTC 11637cagM基因,并制备了其抗体,为以后进一步研究其生物学功能以及H.pylori相关疾病的检测与治疗奠定了基础。

幽门螺杆菌外膜蛋白cagL基因的克隆、表达及其对IL-8 mRNA表达的影响

目的：克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC11637菌株cagL基因,并探讨其对IL-8mRNA表达的影响。方法：设计cagL引物,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后测序分析,用信息学软件分析其物理化学特性,并构建表达载体cagL-PET28 a（＋）转化E.coliBL-21（DE3）,IPTG诱导表达,镍亲和层析纯化,SDS-PAGE及蛋白质印迹鉴定表达蛋白。纯化蛋白与细胞GES-1共培养,提取细胞总RNA,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达。结果：测序分析表明cagL编码成熟肽的碱基序列为654 bp,编码217个氨基酸,与基因库公布的其他H.pylori菌株的基因序列同源性为96%~98%,氨基酸同源性为97%~99%,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域;表达蛋白的相对分子质量约为32 000,蛋白质印迹检测融合蛋白具有良好的抗原活性;重组蛋白作用于GES-1细胞后,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达。结论：CagL蛋白可刺激GES-1细胞IL-8 mRNA的表达。

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)Cag致病岛(Cag-pathogenicity island,Cag-PAI)编码的hp0540基因的原核表达系统,并制备其多克隆抗体。方法:应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段,克隆至pMD18-2T载体后,进行序列测定,并对其序列进行生物信息学分析;构建pET-28a-hp0540原核表达载体,转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE法鉴定目的蛋白的表达,并以Ni2+-NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果:成功克隆了hp0540基因,全长1 086 bp,编码361个氨基酸,与基因库公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性为98%。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为39 000,经Ni2+-NTA柱纯化后可获得重组蛋白,重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1∶160 000的多克隆抗体。结论:成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定了基础。

SmCo7-xHfxCy合金薄带磁性能、相变化及显微结构研究

研究Hf之置换及C之添加对SmCo7-xHfxCy薄带磁性、相变化及微观结构之影响。结果显示随着Hf含量增加,在x=0.1及0.2时,有稳定1:7相之功用;但在x>0.3时会导致1:5相产生,使本质矫顽磁力(iHc)大幅提高,而磁化量降低。最佳磁性出现于成份为SmCo6.9Hf0.1,其磁性能为Br=0.64 T、iHc=0.58 MA/m及(BH)max=69.3kJ/m3。此外,在SmCo6.9Hf0.1薄带中添加C,不仅可将晶粒从未添加之100～400 nm细化到10～80 nm,且会产生具有高饱和磁化量的FCC-Co相,从而大幅提高其磁性。但当C元素添加量大于0.14时,会生成大量的2:17相及Sm2C3相,导致合金磁性大幅下降。当合金成分为SmCo6.8Hf0.1C0.12时,有最佳磁性能:Br=0.69 T,iHc=0.71MA/m及(BH)max=81.2 kJ/m3。

2021-2022年浙江省衢州市B/Victoria系流行性感冒病毒抗原性及基因特性分析

目的了解浙江省衢州市2021—2022年B/Victoria系流行性感冒(流感)病毒抗原性及基因进化特征,为流感防控提供科学依据。方法选取衢州市2021—2022年分离到的14株B/Victoria系流感毒株进行全基因组测序,利用生物信息学软件对其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因进行分子进化特征分析。采用红细胞凝集抑制实验进行抗原性分析。结果10株分离株为同期疫苗株B/Washington/02/2019的类似株,后期分离的4株毒株为疫苗株B/Washington/02/2019的低反应株。同源性分析显示,分离株与下一年度(2022—2023年)疫苗株B/Austria/1359417/2021的匹配性总体高于同期疫苗株B/Washington/02/2019。基因进化分析发现,14株分离株从V1A.3a.1逐渐进化为V1A.3a.2分支,与同期疫苗株B/Washington/02/2019的遗传距离随时间逐渐加大,而与下一年度疫苗株B/Austria/1359417/2021关系渐近且最终聚集在V1A.3a.2分支上。相较于同期疫苗株B/Washington/02/2019,HA氨基酸序列共有14个变异位点,涉及3个抗原表位和1个糖基化位点(197NET);NA蛋白发生了多个氨基酸位点改变,但未发现相关耐药位点变异。结论2021—2022年衢州市B/Victoria系流感病毒处在持续进化之中,与同期疫苗株B/Washington/02/2019的匹配性降低,应继续加强对B/Victoria系流感病毒的监测研究,及时为流感疫苗株的筛选提供科学依据。

2013-2018年浙江省衢州地区外环境禽流感病毒监测分析

目的了解浙江省衢州地区外环境禽流感病毒流行特征,为该地区人禽流感疫情的防控和预测预警提供科学依据。方法采集2013—2018年衢州地区外环境禽流感监测标本,采用实时荧光反转录–聚合酶链式反应方法对采集的外环境标本进行禽流感病毒核酸检测,并进行统计学分析。结果 2013—2018年共采集禽流感外环境标本5 290份,检出流感病毒A型(FluA)阳性标本1 809份,阳性率为34.20%;其中以H9亚型和A型未分型为主,分别占44.50%和29.13%。开化县检出阳性率最高(54.85%),龙游县最低(17.25%)。5类场所中,城乡活禽市场检出阳性率最高(45.94%)。6种类型标本中,宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本检出阳性率最高(58.96%)。第一季度(38.06%)和第四季度(37.23%)检出阳性率较高。不同时间、地区、场所、标本类型的标本阳性检出率差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论衢州地区外环境中存在多种亚型及混合型禽流感病毒,应加强外环境禽流感监测力度,同时采取有效的防控措施降低人群感染的风险。

2015-2017年浙江省衢州市H3N2亚型流感病毒血凝素基因分子进化特征分析

目的了解浙江省衢州市2015-2017年H3N2亚型流感病毒血凝素(HA)基因分子进化特征,为流感防控提供科学依据。方法选取衢州市2015-2017年分离到的H3N2亚型流感病毒18株,通过RT-PCR扩增病毒HA基因片段并测序,采用生物信息学软件分析其分子进化特征。结果 18株H3N2亚型流感病毒HA基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.36%~100.00%和96.76%~100.00%,与同年度疫苗株HA基因的核苷酸平均遗传距离分别为0.008 2、0.007 1和0.011 2,氨基酸平均遗传距离分别为0.009 2、0.003 1和0.010 0。分离株的HA基因分支从3C.3a转变为3C.2a支系,其HA氨基酸序列与同年度疫苗株比较,变异位点共涉及HA蛋白的5个抗原表位(A、B、C、D和E区),2个受体结合位点(T131K、T135N/K),6个潜在糖基化位点(122NES、126NWT、133NGT、135NSS、144NSS、158NYT)。结论 2015-2017年衢州市H3N2亚型流感病毒可能出现了抗原漂移,当前疫苗株A/Hong Kong/4801/2014的免疫效果需重新评估。

衢州市某中学一起诺如病毒感染暴发疫情调查

目的探讨衢州市某中学一起诺如病毒感染疫情的暴发原因和危险因素,为类似疫情的防控提供科学依据。方法制定病例定义、开展病例搜索和个案调查,进行流行病学和现场卫生学调查,采集病例、食品及水样有关标本,进行可疑病原检测。结果此起疫情累计报告病例61例,罹患率为3.71%,临床表现主要以腹泻(98.36%)、呕吐(68.85%)、腹痛(32.79%)为主;28份病例肛拭子中检出诺如病毒GⅡ型核酸阳性13份,阳性率为46.43%;首发病例为食堂员工,食堂员工罹患率最高(16.67%)(χ2=10.418,P <0.05);不同年级学生罹患率差异无统计学意义(P=0.577)。结论该疫情是由诺如病毒GⅡ型感染引发的急性胃肠炎暴发疫情,可能原因为食堂员工污染食物所致。

2011年衢州市流感病毒病原学监测结果分析

目的:探讨2011年衢州市流感流行规律,为做好流感预防控制工作提供科学依据。方法:对本市2011年各流感监测哨点送检的流感样病例标本,进行流感病毒分离培养,用"O"型人血红细胞作微量血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)进行鉴定。结果:2011年共检测流感样病例标本397份,分离出流感病毒23株,其中,流感流行主要发生在1月-3月及10月-12月;男女比例相似,年龄以30岁～39岁为高发人群(11.84%)。结论:2011年衢州市流感流行出现2个高峰期,分布于冬春季节,其中,甲型H1N1型成为当年高检出率的优势流行株,应加强防范对甲型H1N1流感毒株可能造成的流行或暴发。

2012年-2016年衢州市流感病原学监测分析及评价

目的了解2012年-2016年衢州市流感流行特征,并对监测结果进行评价,为本市流感防控工作提供科学依据。方法对本市流感监测哨点医院采集的流感样病例标本,采用实时荧光RT-PCR进行流感核酸检测,用MDCK细胞进行病毒分离。结果 2012年-2016年共检测流感样病例标本4 436份,检出流感病毒阳性567份,总阳性率为12.78%,各监测年度中流感流行优势株均为A(H3N2)型,其他型别交替出现,以冬春季节为主要流行期;不同年龄组中,0岁~阳性率最低(6.00%),60岁~阳性率最高(17.44%);不同监测方法中,核酸检测的灵敏度和特异度均高于病毒分离。结论衢州市流感病毒A(H3N2)型流行一直保持较高活跃状态,应积极防控其引发局部暴发流行的风险;多方法监测能够提供更为准确的监测数据。

维持培养基组分对流感病毒增殖效果的影响

目的探究维持培养基不同组分对流感病毒增殖的影响,提高病毒增殖效率。方法通过改变维持培养基的组分,分别添加不同浓度的TPCK-胰酶、谷氨酰胺、葡萄糖和丁酸钠,用其对流感病毒在MDCK细胞中进行增殖培养,在24h、48h、72h、96h对培养物进行血凝素(HA)滴度测定;同时检测不同浓度的丁酸纳对MDCK细胞活性的影响。结果流感病毒新甲型H1N1、A(H3N2)和B(Victoria)增殖的最佳胰酶浓度为3μg/m L,B(Yamagata)最佳胰酶浓度为2μg/m L;各亚型流感病毒增殖的最适宜谷氨酰胺浓度为4mM;最适宜葡萄糖浓度为(20～30) m M;最佳丁酸钠浓度为0. 5mM,过高的丁酸钠浓度对流感病毒增殖有抑制作用,丁酸钠降低细胞活性的能力随浓度提高而增加。结论调节维持培养基组分浓度能够提高流感病毒的增殖效率,为高效地进行流感病毒分离和流感疫苗生产提供基础数据。

浙江省衢州市1例输入性登革热病例分子流行病学研究

目的调查浙江省衢州市1例登革热输入性病例流行病学特征及病原体分子溯源,为登革热的防控提供依据。方法对2017年输入性登革热病例进行流行病学调查,采集病例血清进行登革热病毒核酸和抗体检测,提取病毒核酸后扩增E基因并测序,利用生物信息学软件进行多序列比对并构建进化树。结果该病例登革热病毒核酸及IgM抗体检测结果均为阳性,基因序列比对及进化分析,病毒株为登革热病毒1型Ⅰ亚型,与东南亚病毒株(登录号KY586429.1、KJ806941.2)亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和99.7%。结论衢州市登革热病毒1型病例可能为来自东南亚的1例输入性病例。

浙江省衢州市首例输入性基孔肯雅热病毒基因特征分析

目的对1例有孟加拉国旅行史的基孔肯雅热病例进行病毒基因特征分析。方法采集患者血清,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测基孔肯雅热病毒(CHIKV)和登革热病毒核酸,反转录PCR(RT-PCR)扩增CHIKV结构基因C-E3-E2-6K-E1片段并测序,计算机软件分析处理基因序列。结果患者血清real-time PCR检测为CHIKV核酸阳性,病毒株编号为QZ0823。对病毒株QZ0823病毒进行测序拼接后共获得CHIKV 5个结构基因全长,包含3 747 bp核苷酸序列,编码1 248个氨基酸,与参考序列核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%～99.9%和99.0%～99.9%,对E1和C-E3-E2-6K-E1核苷酸进行系统进化分析,病毒株QZ0823株与孟加拉国、印度、巴基斯坦的东中南非洲遗传谱系流行株进化关系最近。结论来自病例的CHIKV病毒株QZ0823属于东中南非洲遗传谱系,该病例为输入性病例。

衢州市2011年-2012年5岁以下儿童病毒性腹泻监测结果分析

目的探讨衢州市婴幼儿病毒性腹泻的病原学特点,为病毒性腹泻的防控提供参考依据。方法采集2011年9月-2012年12月在衢州市人民医院、衢州市妇女儿童医院就诊的5岁以下腹泻儿童粪便标本,并进行病毒核酸检测分析。结果对于152份粪便标本实验室检测结果显示,肠道腹泻病毒检出率高达55.26%,其中轮状病毒的阳性检出率最高,为42.11%,其次为诺如病毒11.18%,肠道腺病毒(1.97%),检出率差异有统计学意义。在季节分布上轮状病毒检出率比较差异有统计学意义,且以冬秋季节最高,诺如病毒检出率差异无统计学意义。不同性别、生活环境、年龄的检出率比较差异均无统计学意义。结论 2011年-2012年衢州市病毒性腹泻呈高发状态,其中轮状病毒和诺如病毒是主要的病原之一,肠道腺病毒的检出率较低。应加强对病毒性腹泻,尤其是婴幼儿病毒性腹泻的监测。

浙江省衢州市2019年本地登革热暴发疫情的分子流行病学研究

目的对2019年衢州市本地登革热暴发疫情中检出的登革病毒1型进行序列测定和分子特征分析。方法采集患者血清标本,采用胶体金免疫层析法和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分别检测登革病毒NS1抗原和病毒核酸;采用RT-qPCR方法扩增登革病毒E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革病毒株进行同源性和进化树分析。结果从患者血清标本中检测到登革病毒NS1抗原和病毒核酸,经基因序列比对及进化分析,8株登革病毒均为登革1型的基因Ⅰ型,与JF960228(2010年新加坡分离株)互为姐妹群,且毒力位点1处发生变异。结论从病原学、血清学和分子生物学证实该起暴发疫情是由登革1型病毒引起,该毒株有可能来源于东南亚,应加强中国与该地区登革热跨境传播的防控。

2016-2018年浙江省衢州地区手足口病病原谱及分布特征分析

目的了解2016-2018年衢州地区手足口病病原学构成特征,为该地区手足口病疫情的防控提供科学依据。方法采集2016-2018年衢州地区手足口病监测样本,采用实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)方法对采集的样本进行手足口病相关肠道病毒核酸检测。结果2016-2018年共采集手足口病样本1151份,检出阳性804份,阳性率69.85%;其中以CV-A6和CV-A16为主,分别占38.06%和22.39%。衢江区阳性检出率最高(88.07%),江山市最低(50.55%)。2例重症病例检出EVA71。在病例收集期间,衢州地区手足口病发病在4~7月和9~11月,呈现双峰。在手足口患儿中,男性阳性检出高于女性,发病年龄主要集中在1~3岁,散居儿童发病人数最高。不同时间、地区、患者年龄、性别、相关职业的标本阳性检出率差异均有统计学意义(P<0.05)。结论衢州地区存在多种型别及混合型手足口病相关肠道病毒,应加强监测力度,同时采取有效的防控措施降低人群感染的风险。

2011-2016年衢州市流行性感冒流行病学及病原学特征分析

目的:了解衢州市2011—2016年流行性感冒(流感)流行趋势及其病原学变化特征,为流感防控提供参考依据。方法:收集2011—2016年衢州市流感监测哨点医院流感样病例(ILI)监测资料和流感网络实验室病原学监测结果资料进行描述性分析。结果:2011—2016年衢州市流感流行大体上呈1—3月、6—8月和11—12月三个高峰,总的ILI就诊百分比(ILI%)为4.43%;ILI以15岁以下儿童和少年为主,占70.83%,构成比逐年上升,主要优势流感病毒2011年为新甲H1和B型流感病毒,2013年为新甲H1和H3型流感病毒,2012年、2014年和2015年均为H3型和B型流感病毒;2016年为H3型流感病毒。结论:衢州市流感流行呈现春、夏、冬三个高峰,ILI的高峰与流感病毒检测阳性情况基本一致;暴发疫情主要发生在学校;H3型、新甲H1、B型流感病毒交替出现成为年检测分离优势病毒。