携带NDM-1基因合并膜孔蛋白OmpK36缺失肺炎克雷伯菌耐药性分析

目的对产新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)肺炎克雷伯菌耐药情况、分子分型特点,携带耐药基因、传播方式,及其膜孔蛋白表达情况进行分析,以探讨产NDM-1酶肺炎克雷伯菌耐药机制。方法实验菌分离自前列腺增生患者尿液的标本,对其进行细菌鉴定和药敏试验、改良Hodge试验、EDTA协同试验和多位点序列分型(MLST);采用聚合酶链技术检测β-内酰胺酶相关耐药基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因,并对NDM-1和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因进行序列分析;利用SDS-PAGE电泳检测膜孔蛋白OmpK35、OmpK36;菌株质粒接合实验分析传播方式,对受体菌和接合子进行药敏结果比较。结果实验菌改良Hodge试验阴性、EDTA协同试验阳性,鉴定为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)株,对13种常见抗生素耐药,MLST基因分子分型为ST15;PCR检测其携带NDM-1基因,经序列测定比对确认,同时该菌株还携带KPC基因及SHV基因,未检测到VIM、IMP、OXA-48、GES、GIM基因;OmpK35、OmpK36基因存正点突变及片段缺失的现象,SDS-PAGE分析发现膜孔蛋白OmpK36缺失;质粒接合实验阳性,接合子E.coliJ53对3种碳青霉烯类药物的抑菌圈明显减小。结论了解NDM-1肺炎克雷伯菌携带耐药基因类型及传播方式、膜孔蛋白是否缺失以及分子分型,为指导临床正确使用抗菌药物及流行病学调查具有重要意义。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制及同源性分析

目的分析耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药机制及其同源性,为临床治疗此类耐药菌株感染提供依据。方法收集33株临床分离的CRKP菌株,采用法国梅里埃VITEK 2-compact分析仪进行细菌检测和药敏试验,改良Hodge试验和EDTA纸片协同试验检测耐药表型,PCR法扩增检测碳青霉烯酶基因(8种)及膜孔蛋白基因,ERIC-PCR法及多位点序列分型(MLST)法进行同源性分析及基因分子分型。结果 33株CRKP对米诺环素、复方新诺明、丁胺卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、舒普森、呋喃妥因、氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、左旋氧氟沙星、氨苄西林钠舒巴坦钠、头孢曲松、头孢唑林、头孢吡肟和头孢他啶16种抗菌药物存在多重耐药。改良Hodge试验发现,产金属β-内酰胺酶菌株30株,EDTA纸片协同试验发现产金属β-内酰胺酶菌株1株。PCR检测结果显示,携带KPC基因32株,携带SHV基因30株,携带NDM-1基因1株,未检测出其他耐药基因; ompk35膜孔蛋白基因缺失1株,ompk36膜孔蛋白基因缺失3株。ERIC-PCR法及MLST法结果显示,ST11/A型29株,ST15/B型2株,ST11/C和ST2193/D各1株。结论耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制与其携带KPC耐药基因并产生KPC酶有关;大部分CRKP为ST11/A型,同源性程度高,可在院内克隆性传播。

基于PDANPs和T4 PNK、λexo生物传感技术建立

为找到一种快速灵敏检测miRNA-199的方法,分析纳米材料PDANPs表征,构建基于聚多巴胺纳米粒子(PDANPs)和T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)、λ核酸外切酶(λexo)的新型纳米生物传感技术检测miRNA-199平台,对影响生物传感技术主要因素进行优化,分析其线性范围和检测限;与茎环引物设计荧光定量PCR方法进行比对。结果显示:合成PDANPs直径300.0±31.7 nm,表面含有丰富的π电子;反应体系荧光强度与miRNA-199浓度的对数成线性关系,F=65.183 lg C+157.3、R 2=0.973;线性范围为10 pmol/mL^100 nmol/mL;检出限值为4.62 pmol/mL;与荧光定量PCR法比对结果偏倚为-0.22105 pmol/mL。结果表明,基于PDANPs和T4 PNK、λexo新型纳米生物传感技术可用于miRNA-199检测。

产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌膜孔蛋白OmpK35与OmpK36基因转录水平

目的通过对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌携带耐药基因和分子流行特点及膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因转录水平、膜孔蛋白表达情况分析,了解膜孔蛋白OmpK35、OmpK36在耐药机制中的作用。方法对32株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,进行MLST基因分型;利用PCR技术对产碳青霉烯酶,头孢菌素酶、超广谱β内酰胺酶相关耐药基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因进行检测,并对OmpK35、OmpK36基因进行序列分析;实时荧光定量RT-PCR检测膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因转录水平,用SDS-PAGE检测膜孔蛋白的表达情况。结果 32株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌MLST分型,29株为ST11、2株ST15、1株为ST2193;PCR检测出31株KPC-2阳性,1株NDM-1阳性,32株都检出SHV,其中一株同时检出OXA-48基因。OmpK35、OmpK36基因序列存在点突变、单个碱基和小片段缺失;OmpK35、OmpK36基因转录水平与肺炎克雷伯菌ATCC 13883相比,转录水平不一,大部分明显上调;SDS-PAGE未检测有膜孔蛋白OmpK36缺失株。结论产KPC-2、NDM-1型碳青霉烯酶是导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药耐药并表现多药耐药的主要原因,而膜孔蛋白OmpK35、OmpK36在其耐药中作用未体现。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对耐碳青霉烯类药肺炎克雷伯菌膜孔蛋白检测分析

目的了解基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测菌膜孔蛋白的能力及膜孔蛋白在肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类药物中的作用。方法选取2015-2017年莆田学院附属医院临床分离的耐碳青酶烯类药的肺炎克雷伯菌7株,进行改良Hodge、EDTA试验和多位点序列(multilocus sequence typing,MLST)分型;采用PCR技术检测相关的耐药基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因,并对膜孔蛋白基因进行序列分析;采用超速离心提取膜孔蛋白,分别进行SDS-PAGE和MALDI-TOF MS检测分析。结果7株耐碳青酶烯类药肺炎克雷伯菌MLST分型结果2株ST15型,其他为ST11型,改良Hodge试验阳性菌株6株,EDTA试验阳性菌株1株;PCR技术检测出耐药基因KPC-2、SHV、TEM、NDM-1和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因,膜孔蛋白基因进行序列分析发现存在突变和缺失。SDS-PAGE检测出OmpK36及OmpA;MALDI-TOF MS可检测出OmpA(m/z 36.0×103),OmpK35(m/z 37.2×103)和OmpK36(m/z 38.7×103)三种膜孔蛋白。结论MALDI-TOF MS在膜孔蛋白缺失的检测方面比通用技术SDS-PAGE更有优势,膜孔蛋白结构改变或缺失,合并产超β-内酰胺酶,可导致对碳青霉烯类药耐药。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制的定量蛋白质组分析

为了寻找耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药相关蛋白,本研究通过提取2017年莆田学院附属医院分离的3株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药株和2株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌敏感株的总蛋白,采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术合并液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS)分析和鉴定蛋白表达图谱,筛选差异表达蛋白,并对显著性差异蛋白进行GO功能及KEGG通路富集分析。我们共鉴定出3117个蛋白,定量检测到的蛋白有2920个,其中538个蛋白有显著性差异。GO功能富集分析发现,与肺炎克雷伯菌耐药相关的蛋白有β-内酰胺酶、青霉素结合蛋白、修饰氨基糖苷类的钝化酶、金属肽酶及其它相关蛋白。对β-内酰胺相关蛋白KEGG通路富集分析,涉及β-内酰胺酶活性的KPC型和SHV型基因得到验证。本研究为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制提供了理论依据。