补肾健脾活血方调控Apaf-1/CHOP-Caspase-9/Bcl-2通路抑制成骨细胞氧化应激

目的探讨补肾健脾活血方对减轻大鼠成骨细胞氧化应激损伤和调控线粒体介导的细胞凋亡的机制。方法提取大鼠原代成骨细胞,通过CCK8实验检测补肾健脾活血方干预下对成骨细胞增殖活性的影响、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测成骨细胞ALP活性、茜素红染色检测成骨细胞的矿化情况、实时定量PCR检测Apaf-1和CHOP基因的mRNA表达、蛋白质印迹检测Caspase-9和Bcl-2蛋白表达量。结果CKK8实验和碱性磷酸酶染色表明氧化应激损伤的大鼠成骨细胞增殖活性显著降低,成骨分化受抑制,同时Apaf-1和CHOP的mRNA表达以及Caspase-9的蛋白表达明显增加(P≤0.01),Bcl-2蛋白表达则显著减少(P≤0.01);经补肾健脾活血方干预后,成骨细胞增殖活性得到明显的增强、成骨分化增加,Apaf-1和CHOP的mRNA及Caspase-9的蛋白表达均显著减少(P<0.05),而Bcl-2的蛋白表达则显著升高(P≤0.0001)。结论补肾健脾活血方可以促进成骨细胞增殖和成骨分化,显著降低Apaf-1和CHOP的mRNA及Caspase-9的蛋白表达,升高Bcl-2的蛋白表达量。补肾健脾活血方在减轻成骨细胞的氧化应激损伤和调控线粒体介导的细胞凋亡中起着重要作用。

Beclin 1基因突变对成骨细胞自噬-凋亡表达的影响

目的观察Beclin 1野生型、突变型质粒对成骨细胞自噬-凋亡表达的影响。方法采用原代分离培养的大鼠颅骨成骨细胞,构建Beclin 1突变型质粒转染成骨细胞(MUT)和野生型质粒转染成骨细胞(WT),使用自噬激活剂rapamycin(Rapa)、自噬抑制剂Baf-A1(Baf)和Beclin1/Bcl2结合抑制剂mifepristone(Mif)干预细胞,分为NC组、Beclin1 WT组、Beclin1 WT+Baf-A1组、Beclin1 WT+mif组、Beclin1 Mut组、Beclin1 Mut+Rapa组。使用免疫共沉淀检测Beclin1-Bcl2复合物结合水平,通过MDC染色、溶酶体染色、流式检测、线粒体膜电位检测、Hoechest染色、免疫荧光、WB分别检测成骨细胞的自噬和凋亡表达情况。结果免疫共沉淀检测:与NC组相比,MUT组中Beclin1-Bcl2复合物水平显著降低(P<0.05);MDC染色显示:相对于NC组,WT细胞中溶酶体染色明显增加;细胞凋亡方面:与NC组相比,WT组、WT+Mif组细胞凋亡率显著上升,MUT细胞凋亡率低于WT细胞,比较差异具有统计学意义;JC-1检测显示:与NC组相比,WT细胞的线粒体跨膜电位异常改变,而MUT细胞样本的跨膜电位表达活跃。结论①Beclin 1的过表达可以抑制Beclin 1-Bcl2复合物的生成;②Beclin 1是参与自噬的重要基因,适度的Bcilin 1表达有利于维持细胞群的代谢平衡,Beclin 1的过表达对细胞自噬无明显影响;③Beclin 1过表达能抑制成骨细胞凋亡。

补肾健脾活血方对骨质疏松大鼠肝脏脂肪病变的作用

目的探索骨质疏松(osteoporosis,OP)模型大鼠的肝脏脂肪病变及补肾健脾活血方的作用。方法选取3月龄SPF级雌性大鼠24只,随机分为假手术组(n=6)、模型组(n=18);去卵巢后确定造模成功,随机抽取模型组12只大鼠,使用阿仑膦酸钠(n=6)和补肾健脾活血方(n=6)灌胃12周。取材后使用双能X线骨密度仪(dual-energy X-ray absorptiometry,DXA)检测骨密度(bone mineral density,BMD);microCT观察骨微结构;测量大鼠体重、肝脏重量及计算脂肪比;生化检测血清中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST);油红O染色、HE切片观察肝组织;免疫组化观察谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)。结果与假手术组对比,模型组的ALT、AST水平升高(P<0.05),腰椎骨密度下降(P<0.05);骨小梁数量明显减少,骨微结构受破坏;体重升高,脂肪比升高;肝脏重量升高,肝脏脂肪浸润明显,肝小叶不清晰,肝索不规则,GPX4表达下降;与模型组对比,补肾健脾活血方组脂肪浸润减轻,肝小叶较模型组清晰,肝索较为规则,GPX4表达上升,P<0.05。结论OP可能导致肝的脂肪病变,补肾健脾活血方可减缓去势后大鼠肝脏脂肪病变的能力。GPX4可能在OP与肝脏脂肪病变的发生发展间产生一定的作用。

肌少—骨质疏松症研究现状及展望

骨质疏松症和肌少症作为增龄性骨骼肌肉疾病,与一系列不良身体和代谢结果相关,两者共存将形成肌少-骨质疏松症,有学者称之为21世纪的老年病巨头。肌少-骨质疏松症是一种多因素、多病因的进行性疾病,其病理生理机制可能与衰老导致的遗传、机械、内分泌紊乱相关,出现肌肉或骨骼问题的患者均应进行全面的筛查与评估以及早进行运动锻炼、营养支持、药物治疗等干预,以降低共病状态下的众多负面影响。目前对于肌少-骨质疏松症研究才刚刚起步,对新的综合征的认识还需更多探索和思考,“肌为骨用、肌骨并重”应是肌肉骨骼疾病研究和发展的重要思路。

原发性骨质疏松症的中医认识与探索

中医是中华文明的瑰宝,其独特的整体观、辨证观和平衡观拥有丰富多样的治疗手段。传承创新对于中医药事业的发展至关重要,通过分析“肾主骨理论”“脾肾相关论”“血瘀论”研究骨质疏松症(osteoporosis, OP)的病机与防治,现已取得显著的效果。黄宏兴教授课题组深耕该领域多年,将OP的中医证型归为脾肾阳虚、肝肾阴虚和肾虚血瘀三型,并以补肾、健脾、活血为治则,优化了其中医临床路径,重视患者的生存质量,从脾肾、肌骨和线粒体与OP的发生为研究的切入点,推崇肌骨同治理念,总结提炼出“脾肾-肌骨-线粒体理论”体系,进一步将宏观和微观联系起来开展OP的发病机制和中药复方干预作用研究,进一步丰富了中医药防治OP的理论体系。

骨质疏松症与肌-骨-脂关系研究

背景骨质疏松症作为一种老年慢性疾病,其发病过程缓慢、隐匿,在学术界素有“沉默杀手”之称,而随着机体衰老,肌肉、骨骼和脂肪的生理变化在表型上较为明显。目前针对“肌-骨-脂”与骨质疏松症发病关系的研究较少。目的初步探讨骨质疏松症与肌-骨-脂的关系。方法2019-07-19至2021-01-05广州中医药大学第三附属医院招募符合纳入、排除标准的骨质疏松症患者108例,记录其一般资料〔身高、体质量、体质指数(BMI)〕,采用双能X线吸收法(DXA)检测T值、脂肪质量、肌肉质量和骨矿含量,ELISA法检测钙、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、骨保护素(OPG)等骨形成相关指标;根据患者的不同年龄分组(49~58岁31例、59~68岁57例、≥69岁20例),比较不同年龄组患者的身高、体质量、BMI、T值、脂肪质量、肌肉质量、脂肪百分比和骨矿含量。根据T值将患者分为正常组(T值≥-1.0,n=20)、骨量减少组(-2.5<T值<-1.0,n=38)、骨质疏松组(T值≤-2.5,n=50),比较不同组别间脂肪质量、肌肉质量、脂肪百分比、骨矿含量和骨形成相关指标。结果不同年龄段的患者T值比较,差异有统计学意义(P<0.05);与49~58岁患者相比,59~68岁、≥69岁患者T值降低(P<0.01)。与正常组相比,骨质疏松组脂肪质量降低,骨量减少组和骨质疏松组骨矿含量降低(P<0.05)。与骨量减少组相比,骨质疏松组肌肉质量、骨矿含量降低(P<0.05)。与正常组相比,骨质疏松组OPG、BMP2降低,骨量减少组BMP2降低(P<0.05);与骨量减少组相比,骨质疏松组OPG和B淋巴细胞瘤-2基因(BCL2)降低(P<0.05)。结论“肌-骨-脂”之间的动态平衡与骨质疏松症发病过程可能相关。随着年龄的增大,骨质疏松症患者骨密度下降,血清BMP2、OPG和Bcl2含量降低,这可能与凋亡蛋白不能很好地发挥抗凋亡作用和促骨形成作用,使得成骨细胞活性降低、骨形成活动减弱有关。

生物钟基因Bmal1与骨重塑的研究

骨重塑是修复骨结构的微损伤和替换老化骨组织的过程,对于保持骨骼的稳定性和完整性至关重要。研究发现骨重塑的循环标志物呈现出昼夜节律性变化,骨稳态也受到昼夜节律的影响,昼夜节律紊乱会导致骨质流失。Bmal1基因是生物钟的核心组成部分,在骨代谢细胞中发挥着重要的作用,Bmal1的异常表达将会导致骨重塑失衡。本文将对Bmal1在骨重塑中的作用进行综述,叙述其在成骨细胞、破骨细胞以及骨髓间充质干细胞的作用。旨在深入探索生物钟基因Bmal1与骨重塑的关系,以期为未来治疗骨重塑相关疾病提供新的思路。

基于miRNA-mRNA网络探讨黄芪-山药药对治疗2型糖尿病的作用机制

目的运用生物信息学和网络药理学方法挖掘黄芪-山药药对治疗2型糖尿病的微小RNA(miRNA)-mRNA转录网络,探讨其作用机制。方法通过GEO数据库挖掘2型糖尿病miRNA和mRNA芯片集,并通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)挖掘黄芪-山药药对活性成分及预测靶点,使用R语言及Perl软件筛选黄芪-山药药对治疗2型糖尿病的关键miRNAs及mRNAs,借助Cytoscape3.8.2软件与STRING数据库构建活性成分-靶点网络、miRNA-mRNA转录网络及蛋白互作(PPI)网络,并进行基因本体(GO)功能及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,并借助cytoNCA完成PPI网络的拓扑分析。结果2型糖尿病中存在64个差异miRNA和6143个差异mRNA构成的605组miRNA-mRNA互作关系;黄芪-山药药对存在56个有效成分和538个药物靶点,如PGR、PTGS1、AR、SCN5A、NCOA2等。2型糖尿病-miRNA-mRNA-有效成分-中药调控网络图得到miR-1307-3p-PTPN1、miR-1307-3p-SCN5A、miR-1307-3p-BCL2、miR-1307-3p-CHEK2、miR-1307-3p-E2F2、miR-1307-3p-IL10RB、miR-1307-3p-IRF1、miR-1307-3p-MAPK1、miR-491-5p-PTGS 1共9条miRNA-mRNA相互关系。PTPN1、SCN5A、BCL2、CHEK2、E2F2、IL10RB、IRF1、MAPK1、PTGS1共9个靶点作为miRNA调控黄芪-山药药对治疗2型糖尿病的重要桥梁。GO结果富集在对类固醇激素的反应、对金属离子的反应、对药物的反应、内在凋亡信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始等,KEGG结果富集在脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、p53信号通路等。结论2型糖尿病中存在多个miRNA-mRNA调控网络,黄芪-山药药对以多组分、多功能、多途径的形式,介导IL-17、TNF、p53、HIF-1等信号通路,miRNA-mRNA网络在黄芪-山药药对治疗2型糖尿病中发挥重要作用。

绞股蓝皂苷对C2C12细胞成肌分化的影响

目的研究发现,绞股蓝皂苷不仅具有抗炎、抗衰老等多重作用,而且还能促进成骨细胞增殖分化,保护其氧化应激损伤;本研究拟探讨绞股蓝皂苷对C2C12细胞成肌分化的影响。方法完全培养基培养C2C12细胞,细胞增殖贴壁后用含有不同浓度绞股蓝皂苷的分化培养基诱导细胞分化,每个浓度均设置3个复孔;第5天观察细胞分化的形态、计算细胞的分化活力,Western blot检测相关成肌标志物MYF5和MyoD1的表达,免疫荧光检测MyoD1的表达,Image J软件计算肌管融合指数。结果诱导C2C12细胞分化的第5天可见细胞分化为典型的肌管形态,10 mg/L和5 mg/L的绞股蓝皂苷浓度干预下的MYF5和MyoD1的表达较为显著,且肌管融合指数更高,相较于对照组差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论绞股蓝皂苷可促进C2C12细胞的成肌分化,以10 mg/L和5 mg/L的浓度较好。

“后天养先天”理论探讨肠道菌群在肌少-骨质疏松症中的作用

随着全球人口老龄化进程不断加快,肌少-骨质疏松症受到全社会关注。肠道菌群是人体肠道生态系统的重要组成部分,被称为“人体第二基因库”,在调节肌骨代谢方面具有重要作用;肌少-骨质疏松症是老年人常见的代谢性疾病,对老年人的生活质量有较大的影响,该病在中医理论体系中归属于“痿证”。本文基于“后天养先天”理论的内涵介绍了肠-肌轴、肠-骨轴理论,证明肠道菌群与肌肉、骨骼之间存在相关性,即“微生物-肠-肌骨”之间具有密切联系;强调肠道菌群是肌少-骨质疏松症共同存在的发病因素。同时,基于“后天养先天”理论阐述中医药在调节肠道菌群、防治肌少-骨质疏松症方面具有明显优势,并综述文献说明目前研究现状,提出肌骨共治具有可行性的观点。旨在为深度研究肠道菌群与肌肉、骨骼分子间的联系,发挥中医药治疗肌少-骨质疏松症提供思路。

广东省中老年女性骨质疏松症患者骨密度、中医证型及其影响因素调查分析

目的对广东省中老年女性骨质疏松症患者骨密度、中医证型及其影响因素做横断面研究并探讨分析其关系。方法对广东省内各地(广州市、中山市、佛山市、惠州市、台山市等)医院1 453名骨质疏松症患者进行问卷调查,对所收集的资料采用SPSS统计软件进行统计分析,分析骨密度、中医证型及其影响因素(年龄、绝经年龄/年限,既往骨折史,髋部骨密度,治疗时间等)。结果最终筛选出符合标准的样本共373例,年龄介于48～95岁之间,平均年龄73.56±9.32岁,其中脾肾阳虚证130例,占34.85%,肝肾阴虚证161例,占43.16%,气滞血瘀证75例,占20.11%,其他证型7例,占1.88%。各年龄段、不同绝经年龄组间、不同绝经年限组间的患者骨密度比较差异有统计学意义(P<0.05),是否有既往骨折史和父母是否发生过髋骨骨折的骨密度比较有明显差异(P<0.05),脾肾阳虚证的患者髋部骨密度明显高于肝肾阴虚证(P<0.05),治疗时间大于6个月的患者活动度改善情况和一般情况优于治疗时间少于6个月的(P<0.05),脾肾阳虚证、肝肾阴虚证的患者接受治疗半年以上的治疗效果明显优于不超过半年的,结果具有统计学意义(P<0.05)。结论广东省中老年女性骨质疏松症各年龄段的骨密度有一定的差异性,绝经年龄、绝经年限、既往骨折史、父母髋骨骨折史与骨密度有一定相关性,不同中医证型的患者接受治疗的时间不同其效果亦有差别。

补肾健脾活血方干预沉默DKK1、Sost骨细胞对细胞活性和相关蛋白的影响研究

目的用补肾健脾活血方干预沉默Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)转染的成骨细胞,观察其对细胞活性和相关蛋白的影响。方法将培养好的细胞分为空白对照组(NC组)、沉默DKK1(Ad-sh DKK1)组和沉默Sost(Ad-sh Sost)组,空载腺病毒转染NC组,沉默DKK1和Sost重组腺病毒转染其余两组,再分别给予空白血清和含药血清干预,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性以及骨相关蛋白变化情况。结果 (1)三组含药血清干预后的细胞活性强于空白血清干预后的细胞活性。与空白血清干预的三组比较,含药血清干预后的三组细胞活性在24、48、72 h均增加,尤其在72 h时含药血清对Ad-sh DKK1组的细胞活性作用更强,与同组空白血清比较,差异有统计学意义(P<0.05);(2)三组含药血清干预与空白血清干预比较ALP活性明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。含药血清干预后,与NC组比较,其余两组ALP活性显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),Ad-sh DKK1组和Ad-sh Sost组比较,ALP活性升高不明显;(3)与空白血清干预比较,含药血清干预后三组的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)均升高,与NC组比较,Ad-sh DKK1组OPG、OPN差异有统计学意义(P<0.05和P<0.01),Ad-sh Sost组CTGF、OPG、OPN差异有统计学意义(P<0.05)。结论补肾健脾活血方含药血清可显著促进沉默DKK1、Sost干预后细胞增殖和提高ALP活性,上调沉默DKK1、Sost腺病毒转染细胞CTGF、OPG、OPN的表达。

补肾健脾活血方对大鼠绝经后骨质疏松症的防治作用

目的研究补肾健脾活血方对大鼠绝经后骨质疏松症的防治作用。方法 72只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾健脾活血方组(2.979 g/kg)、阿仑膦酸钠维D3片(Ⅱ)组(1.02 mg/kg),双侧卵巢切除法进行造模。药物干预12周后,双能X射线法检测大鼠腰椎骨密度,骨生物力学检测腰椎最大载荷和刚度,实时荧光定量PCR法检测wnt2、wnt3a、lrp5、lrp6、β-catenin、OPN、Runx2、osterix mRNA表达,Western blot法检测wnt3a、β-catenin蛋白表达。结果与模型组比较,补肾健脾活血方组腰椎骨密度、最大载荷及刚度均明显增高(P<0.05),能显著降低OPN mRNA表达(P<0.05),显著增高wnt3a、lrp5、β-catenin、Runx2、osterix mRNA表达及wnt3a、β-catenin蛋白表达(P<0.05)。结论补肾健脾活血方对大鼠绝经后骨质疏松症有一定的防治作用,其机制可能与调控wnt/β-catenin信号通路和OPN的表达有关。

补肾健脾活血方含药血清提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性

背景:有研究发现中药可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞,而Sost是Wnt信号通路的抑制因子和骨形成中的抑制蛋白,也是一种调控骨分化的拮抗因子,可调控成骨细胞的分化和增殖。补肾健脾活血方是广州中医药大学附属骨伤科医院临床防治骨质疏松症的经验方,对骨形成有促进作用,治疗骨质疏松症疗效显著。目的:应用补肾健脾活血方含药血清干预过表达骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)重组腺病毒转染的成骨细胞,观察其对细胞增殖、碱性磷酸酶活性和相关蛋白的影响。方法:将培养好的成骨细胞分为空白对照组、过表达Sost组(Ad-Sost组)2组,空白对照组给予空载腺病毒转染,Ad-Sost组予过表达Sost重组腺病毒转染,两组分别给予空白血清和含药血清干预,采用CCK-8检测细胞增殖、碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性,Western Blot检测骨调节蛋白表达情况。结果与结论:(1)与空白血清干预比较,两组含药血清在24,48,72 h均可以提高细胞活性(P均<0.01);(2)与空白血清干预比较,两组含药血清均可以提高碱性磷酸酶活性(P<0.01);(3)与空白血清干预比较,空白对照组含药血清可以降低低密度脂蛋白受体相关蛋白5、骨保护蛋白的表达(P均<0.01),对骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α蛋白的表达无明显影响,Ad-Sost组含药血清也可以降低低密度脂蛋白受体相关蛋白5、骨保护蛋白、骨桥蛋白蛋白的表达(P均<0.01),提高肿瘤坏死因子α蛋白的表达(P<0.01);(4)结果说明,补肾健脾活血方含药血清可以提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性,影响低密度脂蛋白受体相关蛋白5、骨保护蛋白、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子α蛋白的表达。

山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞的增殖及成骨分化的影响

目的基于Wnt信号通路及内质网应激研究山茱萸新苷Ⅰ对大鼠原代成骨细胞的增殖及成骨分化的影响。方法提取原代成骨细胞,CKK8实验检测在药物浓度下山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞增殖的影响;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下成骨细胞ALP的活性情况;Real-time PCR检测Wnt2、β-catenin、BMP2、OPG、NOX4、PERK基因mRNA的表达;Western blot检测Wnt2、β-catenin、PDI、CHOP和BIP蛋白表达量。结果CKK8实验及ALP染色表明山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞增殖及分化有一定影响,不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下成骨细胞出现不同程度的增殖;与空白对照组相比,山茱萸新苷Ⅰ组的Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG、NOX4的mRNA表达水平显著升高(P<0.01),而PERK明显降低(P<0.01)。与空白对照组相比,山茱萸新苷Ⅰ组的成骨细胞Wnt2、β-catenin、PDI蛋白表达量显著升高(P<0.01),CHOP表达亦有轻微上升,但不明显(P>0.05),而BIP的蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论山茱萸新苷Ⅰ浓度为1 mmol/mL时在促进成骨细胞的增殖分化的作用上表现最佳,其能显著升高成骨细胞Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG和NOX4的mRNA表达水平,而降低PERK的mRNA表达水平,升高Wnt2、β-catenin、PDI的蛋白表达量,降低BIP的表达量,在山茱萸新苷Ⅰ的干预下,Wnt信号通路及内质网应激途径对成骨活动的发生发展起着重要作用。

脾肾-肌骨-线粒体理论探析

黄宏兴教授课题组长期致力于研究骨质疏松症的中医药防治,首次提出脾肾-肌骨-线粒体理论,历年来的相关研究使得该理论逐步完善。本文通过整理相关资料,明确脾肾、肌骨、线粒体三者关系,精炼出该理论的核心内容:骨质疏松与脾肾、线粒体、肌骨关系密切;脾肾-肌骨-线粒体理论基本内容包含了脾肾共司肌骨、线粒体功能与脾肾相通两个核心内容。脾肾-肌骨-线粒体理论是结合中医学中的"脾肾相关""脾主肌肉""肾主骨"和现代生物学中的线粒体功能发展而来,其充分运用中医辨证施治原则,在防治骨质疏松症实际应用中发挥着重要作用。本文通过介绍该理论的演变、发展沿革及应用,为骨质疏松症的防治提供实验研究和临床应用相关材料。

过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化

背景:雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症的主要发病机制,而关于雌激素相关受体α(estrogen-relatedreceptor alpha,ERRα)与骨质疏松症的相关性研究较少,ERRα在骨质疏松症中的具体作用及其机制在目前尚不明确。目的:研究过表达ERRα对沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染的MG63细胞和相关蛋白的影响。方法:构建过表达ERRα和沉默Bak1、Bcl2腺病毒载体,将培养好的MG63细胞分成空载病毒组、Ad-shBak1组、Ad-sh Bcl2组、Ad-shBak1+shBcl2组,过表达ERRα进行干预。MTT法检测细胞增殖,考马斯亮蓝蛋白定量检测碱性磷酸酶活性,流式法测定钙离子浓度,Western blot法分析骨调节蛋白(骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、肿瘤坏死因子α)的表达。结果与结论:(1)与空载病毒组对比,Ad-shBak1组的细胞活性、碱性磷酸酶活性均升高,钙离子浓度降低,各骨调节蛋白除肿瘤坏死因子α降低外,其余均升高;Ad-shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性、结缔组织生长因子均降低,但无显著性意义(P> 0.05),钙离子浓度、骨形态发生蛋白4、Runt相关转录因子2均降低,骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α显著升高(P <0.01);Ad-shBak1+shBcl2组的细胞活性、碱性磷酸酶活性稍升高,钙离子浓度稍降低,各骨调节蛋白水平均升高,但差异不明显(P> 0.05);(2)与Ad-sh Bcl2组比较,Ad-shBak1组与Ad-shBak1+shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性升高,钙离子浓度显著降低,除肿瘤坏死因子α水平显著降低外,其余骨调节蛋白水平显著升高(P <0.01或P <0.05);(3)结果提示,过表达ERRα可提高重组腺病毒Bak1转染后的MG63细胞增殖和碱性磷酸酶活性,降低钙离子浓度,且对骨调节蛋白有一定影响作用。

绞股蓝皂苷减轻H2O2诱导大鼠成骨细胞氧化应激损伤的机制

背景:绞股蓝皂苷具有抗氧化作用,多应用于降血压、抗衰老、抗肿瘤等,但其具体保护机制尚不明确,对氧化应激损伤的成骨细胞增殖、分化的影响亦未知。目的:探讨绞股蓝皂苷减轻大鼠成骨细胞氧化应激损伤的机制,以及对氧化损伤的成骨细胞的增殖、分化的影响。方法:采用分离乳鼠颅骨细胞的单层培养法培养成骨细胞,实验分为3组,以普通生长培养基为空白组,以普通生长培养基+氧化损伤为对照组,以含绞股蓝皂苷的培养基+氧化损伤为实验组。实验组和对照组成骨细胞经含150μmol/L H2O2的生长培养基诱导氧化损伤模型。干预3,5 d CCK8法检测绞股蓝皂苷对氧化损伤的成骨细胞活性的影响;在诱导后第7天采用碱性磷酸酶染色检测成骨细胞碱性磷酸酶的活性;诱导第21天采用茜素红染色观察成骨细胞矿化情况;Western blot检测NOX4、骨形态发生蛋白2和Smad4的蛋白表达量。实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准。结果与结论:①绞股蓝皂苷可促进氧化损伤的成骨细胞增殖;②碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果表明绞股蓝皂苷对受氧化应激损伤的成骨细胞的分化有一定促进作用;③与对照组相比,绞股蓝皂苷可下调实验组NOX4蛋白的表达,上调实验组骨形态发生蛋白2和Smad4蛋白的表达(P<0.05);④结果说明,绞股蓝皂苷对H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用,并且对损伤的成骨细胞有促进增殖分化的作用,其机制可能与抑制NOX4蛋白表达并激活BMP/Smad通路有关。

沉默ERRα对Bak1、Bcl2腺病毒转染骨细胞的影响研究

目的研究沉默雌激素相关受体α(estrogen-related receptor alpha,ERRɑ)对沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染的人成骨样细胞MG63的细胞活性以及相关蛋白的影响。方法构建Bak1、Bcl2腺病毒载体,将shBak1、shBcl2腺病毒载体转染的MG63细胞分成空载病毒组(NC对照组)、沉默Bak1组、沉默Bcl2组、沉默Bak1+Bcl2组四组,再用ERRɑ干预上述四组细胞,MTT法检测细胞增殖,考马斯亮蓝蛋白定量检测碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性,流式法测定钙离子浓度,Western blot法分析骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4,BMP-4)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达。结果 a)与NC对照组比较,(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)组细胞活性、ALP活性、CTGF、OPN、Runx2明显升高(P<0.01),BMP-4(P<0.05)、钙离子浓度、TNF-ɑ明显降低(P<0.01),(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组细胞活性、ALP活性、BMP-4、CTGF、OPN、Runx2均显著降低(P<0.01),钙离子浓度和TNF-ɑ明显升高(P<0.01),(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)组的钙离子浓度、BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ均降低(P<0.05);b)与(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)组比较,(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组与(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)组细胞活性、ALP活性、CTGF、OPN、Runx2明显下降(P<0.01),钙离子浓度明显升高(P<0.05),(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组BMP-4、TNF-ɑ均显著降低(P<0.01),(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)组TNF-ɑ明显升高(P<0.01);c)与(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组比较,(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)组的BMP-4、CTGF、OPN均升高,细胞活性、钙离子浓度、TNF-ɑ均降低(P<0.01)。结论 ERRɑ沉默可提高Bak1沉默的细胞活性、BMP4、CTGF、OPN、Runx2表达量和降低钙离子浓度、TNF-α表达量;可降低Bcl2沉默的细胞活性、BMP4、CTGF、OPN、Runx2表达量和提高钙离子浓度、TNF-α表达量。

补骨脂对成骨细胞和破骨细胞增殖分化的影响研究进展

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏,导致骨脆性增加,易于发生骨折为特征的全身性骨骼疾病。骨质疏松的发病机制为骨重建动态平衡被破坏,成骨细胞与破骨细胞功能失衡,导致骨代谢失衡,骨吸收加快,骨形成减少,最终造成骨吸收远大于骨形成,净骨量丢失。骨质疏松的形成与成骨细胞和破骨细胞二者在体内的动态平衡密切相关,其中破骨细胞主要介导骨吸收,在骨骼的形成和骨密度的调节中发挥着重要作用;成骨细胞则是特殊的骨形成细胞,能合成骨基质,调节机体的骨矿化,参与骨重塑等活动。