宫腔压力检测辅助四维宫腔输卵管超声造影评估输卵管通畅性的临床价值

目的 探讨宫腔压力检测在四维宫腔输卵管超声造影(4D-HyCoSy)评估输卵管通畅性中的辅助作用及临床价值。方法 选择2019年2月至2022年9月在永州市中心医院就诊并接受治疗的132例疑似卵管性不孕患者为研究对象。所有患者均接受4D-HyCoSy检查。以腹腔镜通液检测结果为诊断金标准,与4D-HyCoSy检查结果的诊断进行对比分析。采用受试者工作特征(ROC)曲线和Logistic回归模型分析宫腔压力检测辅助4D-HyCoSy检查在输卵管通畅性诊断中的应用价值。结果 对132例患者完成了4D-HyCoSy检查,在264条输卵管中,145条通畅(54.92%)、77条通而不畅(29.17%)、42条完全阻塞(15.91%);腹腔镜通液检测结果显示,有132条通畅(50.00%)、77条通而不畅(29.17%)、55条完全阻塞(20.83%)。在4D-HyCoSy检查中,有216条输卵管符合腹腔镜通液检测结果,诊断符合率为81.82%(216/264);其中4D-HyCoSy检查与腹腔镜通液检测输卵管通畅的诊断符合率最高,为93.18%(123/132)。从输卵管的功能角度分层评估,4D-HyCoSy检查与腹腔镜通液检测输卵管的诊断符合率为86.36%(114/132)。双侧通畅(A组)、不完全通畅(B组)、双侧阻塞(C组)三组宫腔压力峰值比较差异有统计学意义(F=39.334,P<0.001)。A组与B组、A组与C组、B组与C组之间的宫腔压力峰值比较差异均有统计学意义(t值分别为28.178、66.049、30.774,P<0.001),阻塞越严重,宫腔压力峰值越大。ROC曲线分析显示,宫腔压力检测辅助4D-HyCoSy评估输卵管通畅性预测模型的曲线下面积(AUC)为0.853、灵敏度为88.13%、特异度为79.46%,明显高于4D-HyCoSy单项诊断结果。结论 宫腔压力检测辅助4D-HyCoSy检查可显著提高输卵管通畅性的诊断效能,其可作为临床评估输卵管通畅性的有效诊断方法,可在临床推广应用。

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA(amiRNA)干扰载体(该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因)转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强(P<0.05)。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan—GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料，采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白，对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明，采用理想的蛋白质裂解液（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，4％CHAPS（3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐），65mmol二硫苏糖醇，0．5％IPG缓冲液pH3～10或pH4～7，全蛋白酶抑制片剂（片／10mL））裂解蛋白，以150μg上样，按IEF程序Ⅱ（30V，12h；200V，1h；500V，1h；1000V，0．5h；10000V，2h；10000V，8h）进行等电聚焦，10％SDS—PAGE胶浓度进行第二向电泳，银染方法检测，可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。

一种适用于油菜、大豆、花生、芝麻四种油料作物种子的RNA提取方法

油料作物种子中,大量油脂、蛋白、酚类物质的存在和易氧化的特点导致RNA提取困难。为了解决这一问题,本研究在商业化RNA提取试剂盒的基础上,通过以下3方面的改进,使之成功应用于油菜、花生、芝麻和大豆的各个时期种子RNA提取和后期的荧光定量分析实验:1)增加抗氧化剂巯基乙醇和PVP;2)根据不同作物的油脂含量调整氯仿的比例;3)改进RNA沉淀方法,加大洗脱液体积后用乙醇沉淀。与常规的CTAB、TRIZOL及文献报道的RNA提取方法比较,本方法提取的RNA更完整、得率更高、纯度更高;所得RNA被成功应用于FAD2基因的荧光定量表达分析,发现了四种作物种子不同发育时期的FAD2基因的表达差异,证明了改良方法的有效性。

利用高密度SNP标记定位甘蓝型油菜株高QTL

为了提高甘蓝型油菜株高的分子标记辅助育种效率,以888-5（矮秆）×M083（高秆）构建的重组自交系为材料,通过利用新开发的油菜60K SNP芯片对群体进行SNP标记分型,并结合单环境和多环境2种QTL检测方法对4个环境下株高进行了QTL定位及其与环境互作分析。结果表明：2种QTL定位方法,共检测出27个油菜株高QTL,分布于8个连锁群（A2、A4、A5、A6、A9、A10、C3和C7）,单个QTL可解释的表型变异为0.70%~26.10%。其中6个QTL与环境存在互作效应,在4个环境下效应大小不一,但效应方向表现一致。主效QTL q PH2-4在2个环境下重复检测到,对表型变异解释为17.96%~26.10%,而且有2个SNP标记距离该QTL的最大峰值小于0.2c M。这些QTL为油菜株高的遗传改良提供了有用的遗传信息。

苏云金杆菌对甜菜夜蛾毒性的筛选

测定了 10 0株野生型苏云金芽孢杆菌菌株对夜蛾科甜菜夜蛾幼虫的毒力活性 ,经回归分析 ,2 3株对甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力与浓度有高相关性 (R >0 .90 ) ,按LC50 计算 ,CN73活性最强 ,LC50 达 2 .393微升培养液 /克饲料 ( μL/g) ;另有 2 3株进行了不同浓度下校正死亡率的比较 ,得到高毒株 13株 ,CN33在 5μL/g浓度下校正死亡率达到 10 0 %。该结果为进一步研究奠定了基础。

甘蓝型油菜分枝数QTL定位及其候选基因预测

分枝数是影响油菜产量的重要株型性状之一.为了有助于油菜分枝数的分子标记辅助育种,以甘蓝型油菜品系888-5（多分枝）和M083（少分枝）杂交形成的重组自交系（RIL）群体为材料,通过利用第一张油菜60KSNP芯片对群体进行高通量SNP分型,并结合单环境和多环境2种QTL检测方法对RIL群体在4个环境（武汉-2012、武汉-2013、扬州-2012和扬州-2013）下分枝数进行QTL定位.结果表明：共检测出18个分枝数QTL,分布于A2、A6、A7、C1和C4连锁群.其中11个QTL在2个以上环境下可重复检测到;有2个QTL与环境之间存在互作效应.主效QTL2个（qBN2-3和qBNE2-1）,分别在3个、4个环境下重复检测到,可解释的表型变异为13.12% ～20.60%,2.80% ～30.10%.qBNE2-1与环境存在互作效应.另外,通过利用SNP标记侧翼序列和油菜基因组比对作图,从3个QTL（qBN2-1、qBN7-6和qBN7-8,三者可解释的表型变异分别为19.40% ～17.30%、5.70% ～12.21%和7.88% ～10.32%）的基因组区段内（分别为279kb、165kb和562kb）共筛选出4个与分枝数有关的候选基因,它们的拟南芥同源基因（分别为CUC2、PIN3、F23N20.8和PIN4）均参与拟南芥分枝数的分化或形态建成.

甘蓝型油菜Bn19070的表达与同源基因At2g19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bn19070与拟南芥At2g19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2g19070入手,利用amiR-NAi(人工微RNA干扰)技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90%以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2g19070基因的干扰对Bn19070的功能研究有借鉴作用。

芸薹属AC基因组中SUC基因家族的鉴定与进化分析

为分析芸薹属AC基因组中SUC基因(负责蔗糖和质子同向转运的蛋白基因)家族的扩张与丢失,基于已公布的白菜和尚未公布的甘蓝及甘蓝型油菜基因组数据对SUC基因进行全基因组鉴定,并分析基因结构域特征、生化特征、进化关系和表达特性。依据HMMER程序构建的SUC基因家族的HMM(隐马尔科夫)模型,在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中,各检索出12、11和24个SUC候选基因;通过用SUC家族特征进行筛选,最终各保留了12、4和7个SUC基因;通过对SUC基因在拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的系统发育分析,SUC基因家族在芸薹属物种中分成了3个亚类。利用MCscan对这4个物种基因组的共线性分析,结果表明SUC基因家族成员在芸薹属物种基因组加倍后以及白菜和甘蓝杂交形成油菜以后发生了不同程度的丢失。同时,序列生化特性预测结果表明SUC蛋白是属于偏碱性的疏水性蛋白且结构稳定;表达谱分析显示,所有SUC基因基本上在所有的组织中都有不同程度的表达;启动子分析表明,SUC基因的启动子区富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件,因而该基因可能也与抗逆性相关。

甘蓝型油菜BnERF104超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

根据拟南芥乙烯响应因子AtERF104的序列设计保守引物,从甘蓝型油菜品种中双9号中克隆到同源基因BnERF104。序列分析表明BnERF104蛋白含有一个典型的ERF domain保守结构域,属于乙烯响应转录因子ERF家族的成员。甘蓝型油菜用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)接种6h后,BnERF104基因被诱导显著上调表达。BnERF104基因在转基因拟南芥中的超表达提高了病原相关蛋白(PR)防御素PDF1.2和几丁质酶ChiB基因的表达量,显著增强了对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。

甘蓝型油菜BnEIN3基因的克隆及菌核病诱导表达研究(英文)

乙烯不敏感转录调节基因（EIN3）是定位于细胞核上的乙烯信号转导下游元件，其作为转录因子启动一系列转录级联反应，从而激活乙烯诱导的防御相关基因的表达。拟南芥EIN3功能缺失突变体表现出对死体营养型病原菌高度敏感，表明该基因在抗死体营养型病原菌中发挥一定作用。为克隆甘蓝型油菜EIN3（BnEIN3）基因，该研究采用荧光定量PCR研究菌核病不同抗性的油菜品种接种核盘菌后，BnEIN3的表达变化及差异，初步探讨了BnEIN3在油菜菌核病防卫反应中的作用。

甘蓝型油菜BnEIN3基因克隆及菌核病诱导表达

[目的]探讨甘蓝型油菜EIN3(BnEIN3)基因与菌核病抗性的关系。[方法]根据GenBank中已公布的拟南芥EIN3基因的保守区及甘蓝型油菜EST序列,设计特异性引物,分别进行基因组PCR和RT-PCR扩增,克隆BnEIN3基因。对菌核病不同抗性的3个油菜品种中BnEIN3的表达进行荧光定量PCR检测分析。[结果]克隆得到1 947 bp的基因片段,与拟南芥EIN3一致性高达82%,有完整的开放阅码框,编码614个氨基酸,其中包含1个EIN3结构域,初步认定该片段为油菜BnEIN3基因。在高抗品种(D083)中,菌核病在侵染后期快速诱导BnEIN3上调表达,且显著高于中抗(中双9号)及高感品种(84039)中该基因的表达水平。在中抗及高感品种中,菌核病均抑制BnEIN3的表达,且中抗品种BnEIN3表达量一直大于高感品种。[结论]BnEIN3可能与油菜对菌核病抗性相关。

植物内切β-1,4-葡聚糖酶基因研究进展

植物内切β-1,4-葡聚糖酶基因在植物生长发育过程中扮演重要角色。近年来,随着分子生物学的不断发展,对其研究也取得了重要进展。综述了植物内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、功能、表达调控以及编码蛋白质的结构、底物等方面的研究进展,可为进一步阐明该基因对植物生长发育的影响提供依据。

甘蓝型油菜RIL群体株高性状的全基因组关联分析

为提高甘蓝型油菜株高的分子标记辅助育种效率,挖掘与株高相关的功能基因以构建理想株型,利用单个重组自交系（RIL）群体在3个环境下的株高表型数据及7 877个SNP标记的基因型分型数据进行全基因组关联分析。在2个或2个以上环境下同时检测到5个与株高显著相关的SNP（Bn-scaff_15794_3-p62430、Bn-A02-p9599263、Bn-A02-p9409799、Bn-A02-p9993945和Bn-A02-p9636219）,均位于A02染色体上。比较利用连锁分析方法的QTL定位结果,发现标记Bn-A02-p9599263和Bn-scaff_15794_3-p62430分别位于QTL（q PH2-2和q PH2-4）峰值处,标记Bn-A02-p9636219和Bn-A02-p9993945分别落在QTL（q PH2-3和q PH2-4）2-LOD的置信区间内,标记Bn-A02-p9409799距离QTL（q PH2-2）的置信区间0.3c M。利用关联分析定位的区间（69.5~80.7c M）比利用连锁方法定位的QTL区间（60.7~95.9c M）缩小了24c M。依据参考基因组信息,在标记Bn-scaff_15794_3-p62430附近2kb处找到1个与株高性状相关的候选基因（GSBRNA2T00090973001）。结果表明,单个RIL群体进行全基因组关联分析可以对连锁QTL分析结果进行补充,缩小QTL置信区间。

甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF(乙烯相应转录因子)保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白(PR)防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。

白菜型油菜PABP5基因启动子的克隆及表达特性分析

本研究中利用基因组步移法从白菜型油菜中克隆到Poly(A)结合蛋白基因PABP5起始密码子上游长588bp的一段序列,经软件分析预测表明,该序列具有典型的启动子结构,并且具有多个与花药特异性表达相关的顺式作用元件,如TATA box,CAAT box,AGAAA motif,AGGTCA motif,AAACCCTAA motif,GTGA motif等。为了研究该片段的表达特性,本文将克隆到的序列置换pPBI121中的CaMV35S启动子,驱动其下游的GUS基因,构建了植物表达载体,转化拟南芥,获得了转基因植株。组织化学染色表明,在PABP5启动子Ppabp5的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的根尖、第一片真叶叶原基以及花药中特异表达。本研究为PABP5基因的进一步功能研究奠定了基础。

苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析

以pBeloBAC11为载体,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组人工染色体(BAC)文库和质粒BAC文库。根据已克隆的包含复制子ori165在内的3.6kb片段中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针,通过染色体步移方式,对质粒文库和基因组文库进行筛选,得到13个覆盖YBT-1765菌株中质粒pBMB165不同区域的克隆子。通过HindⅢ和BamHⅠ酶切分析,建立了质粒pBMB 165的物理图谱和线状重叠连锁图,并测算出该质粒的大小为82kb。根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB 165上转座因子的存在机率。YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案,成功解决了大质粒难克隆的问题。

苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中稳定质粒

从苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT_1765中克隆得到一个大小约15.2kb的质粒pBMB175,构建了该质粒的限制性图谱,通过功能验证,将其最小的复制区定位在一个1151bp的片段上。分析了包含有这个复制区的一个大小为4152bp的核苷酸序列,该片段包含有3个编码框(ORF1、OFR2和ORF3)。氨基酸序列同源性比较发现,ORF1(767AA)与UvrD_旋促酶、重组酶RecD和RecB家族具有20%～30%的相似性;ORF2(149AA)没有发现与任何已知序列具有同源性;ORF3(83AA)与pGI3中一个未知功能的蛋白(ORF7)具有34%的相似性。通过缺失及序列比较分析推测ORF2可能编码一种新的复制蛋白。因此pBMB175的复制类型可能属于一类新的复制家族。利用最小复制区构建的重组质粒在无抗生素选择压力下可稳定遗传40多代,具备构建稳定遗传质粒载体的潜力。

拟南芥抗菌核病突变体275-7的初步研究

草酸是核盘菌致病过程中产生的毒素因子。以菌核病菌毒素草酸(3mmol/L)为筛选压,从1000个拟南芥T-DNA插入突变体中筛选出了1个草酸不敏感突变体,命名为275-7。通过拟南芥活体接种对突变体275-7进行菌核病抗性鉴定,与野生型相比,突变体275-7对菌核病的抗性显著增强(P<0.05);荧光定量PCR检测结果表明,275-7中茉莉酸途径的标志基因PDF1.2的表达量是野生型的12倍,而水杨酸途径的标志基因PR1基因的表达量与野生型比较无差异。推测拟南芥突变体275-7可能通过增强水杨酸介导的防卫反应,从而表现出对菌核病的抗性。

甘蓝型油菜株高性状的全基因组关联分析

适当的株高不仅是抗倒性和机械化收获的需要,而且是建立高产理想株型的需要。本研究测定来自世界油菜主产国的371份种质资源材料构成的自然群体的株高,利用60K SNP芯片对该群体进行基因型检测,获得了21 856个SNP,利用这些SNP和株高数据进行全基因组关联分析,结果表明:(1)检测到4个与株高显著关联的SNP,即Bn-A07-p3583161、Bn-scaff_22790_1-p1271170、Bn-scaff_20735_1-p42779和Bn-scaff_18702_1-p589589,分别分布于A07、C01和C02染色体;它们对表型变异的解释率分别为11.33%、11.75%、12.31%和10.97%;(2)参考基因组信息,在上述前3个SNP附近的492.0、9.5和69.5 kb处分别找到一个与株高性状相关的候选基因;(3)4个显著SNP各自的等位基因间表型均值差异分别为11.09、15.12、10.48和8.93 cm,双尾t测验结果表明各等位基因组间差异显著。