斑点叉尾源维氏气单胞菌对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因的检测

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）为气单胞菌属（Aeromonas）的一种,亦被称为维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌和维隆气单胞菌,存在于水体和淤泥等环境中[1],能够感染斑点叉尾（Ictalurus punctatus）[2,3]、锦鲤（Cyprinus carpio L.）[4]、西伯利亚鲟（Acipenser baerii）[5]、鲱形白鲑（Coregonus clupeaformis）[6]、华鲮（Sinilabeo rendahl）[7]、框镜鲤（Cyprinus carpio）[8]等多种鱼类。其中,斑点叉尾感染维氏气单胞菌近几年才被发现,其发病率可达30%以上,病鱼死亡率在50%以上,给养殖户造成了巨大的经济损失,也严重制约了斑点叉尾养殖业的健康发展[2,9]。

38株维氏气单胞菌分离株的AFLP基因分型研究

试验通过人工设计合成的通用接头以及与接头序列相匹配的专用引物,对38株维氏气单胞菌分离株和1株维氏气单胞菌标准菌株进行AFLP基因分型研究。结果显示,采用5对引物使39株维氏气单胞菌扩增出1080条可见条带,片段长度在50—1000 bp之间,其中多态性条带727条,平均每对引物组合产生154条多态性条带,平均多态性检出率为66.7%。按UPGMA方法对条带进行聚类分析,建立聚类分支树状图,将39株维氏气单胞菌分为9个基因型,其中第四类群基因Ⅳ型包含了14株菌株,约占总菌数的35.9%,分布在5个不同的地区,推测其可能是引起斑点叉尾发病的主要流行性基因型。不同地区分离的维氏气单胞菌具有地域性差异,而同一地区分离株既存在相同基因型现象,也存在基因型多样性现象。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)三重PCR快速检测方法的建立与应用

参照GenBank发表的无乳链球菌sip、cpsE这两个高度保守基因设计两组特异性引物,应用已报道的无乳链球菌cpsL基因高度保守序列的引物作为阳性对照引物,经反应条件和反应体系参数优化,建立一种检测无乳链球菌的三重PCR方法,并应用本三重PCR方法检测40尾人工感染罗非鱼样本和22尾临床上收集的疑似无乳链球菌感染鱼样本。结果表明,所建立的三重PCR方法具有良好特异性,检测无乳链球菌DNA样本时出现三条扩增条带,检测其他7种供试菌株DNA则不出现出任何扩增条带,对无乳链球菌DNA样本的最低检测浓度为0.32ng/μl,最适Mg2+浓度为37.5mmol/L,整个检测过程耗时100min左右。40尾人工感染罗非鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率分别为100%,22尾疑似无乳链球菌感染鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率分别为72.7%,以上两批样本检测结果与常规细菌鉴定方法结果一致。

海豚链球菌(Streptococcus iniae)胞外产物对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的致病性

采用硫酸铵盐析法提取海豚链球菌DGX07菌株的胞外产物(ECPs),通过平板扩散法对其主要酶成分进行初步研究,对酶热稳定和溶血活性进行测定;并对腹腔注射接种海豚链球菌(S.iniae)胞外产物的斑点叉尾进行组织病理学观察。结果显示,菌株胞外产物具有蛋白酶、DNA酶和溶血活性;DNA酶表现出一定的热稳定性,而蛋白酶和溶血活性在80℃或100℃作用10min均丧失;胞外产物对人(O型)、兔、斑点叉尾、草鱼、鲤鱼、鲫鱼、黄颡鱼和长吻的红细胞均表现出不同程度的溶血活性;人工感染试验显示,0.222mg/ml的S.iniaeECPs对斑点叉尾具有明显的致病性,死亡率达100%;临床特点表现为:游动缓慢、体表褪色、鳍条边缘褪色,内脏器官肿胀并伴有腹水;组织学病变主要表现为全身性多组织、器官炎性水肿,伴有组织内出血,实质细胞变性和坏死,尤以肝胰脏、脾脏、肾脏、肠道和心脏的损伤最为严重。试验结果表明海豚链球菌胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。

罗非鱼主要疾病介绍与防治技术(一)

随着罗非鱼养殖规模的扩大、集约化程度的提高，“抗病力强”的罗非鱼也难逃疾病的威胁。近年来病害的时有暴发更是阻碍了罗非鱼健康养殖的可持续发展，如2009年在我国南方暴发的罗非鱼链球菌病就给罗非鱼养殖带来了巨大的损失。本文就目前罗非鱼疾病的病原学、流行病学、诊断技术和防治等方面的研究情况进行介绍，为广大基层水产工作者和养殖户在对罗非龟疾病的防控上提供参考。

罗非鱼主要疾病介绍与防治技术(四)

11.营养素缺乏疾病罗非鱼在养殖过程中,由于外源摄入的蛋白质、维生素、矿物质等不能满足鱼类的正常生长需要,从而表现为营养素缺乏的症状。越冬后的罗非鱼易发病,这是由于当天气转暖,罗非鱼生命活动渐趋活跃,冬季罗非鱼维生素和无机盐易出现积累不足,体内营养素需求又不能及时满足,

2009年8-9月海南罗非鱼暴发性疾病初探

2009年7月下旬起，在海南省多处罗非鱼养殖塘陆续暴发疾病，各地症状大同小异，据走访了解，该病往年也有技生，但2009年尤为突出，且药物治疗效果差，2009年发病率高达40％，发病鱼死亡率接近100％，养殖户损失惨重。本研究中心于8月下旬至9月底分别从海南省多处罗非鱼发病集中区采样，并对所采样品进行了病原学研究，对分离株进行药敏分析。现将相关工作结果简介如下，以期能给相关疾病的防控提供参考。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)荚膜多糖合成基因研究进展

无乳链球菌是一种人畜鱼共患的重要病原菌,菌体表面的荚膜多糖是公认的毒力因子,其合成过程受荚膜多糖合成基因的调控。荚膜多糖合成基因存在于荚膜多糖操纵子中,参与无乳链球菌荚膜多糖的合成启动、寡糖和多糖的聚合以及外输并锚定于菌体表面,在新型诊断技术和减毒突变株的构建方面取得良好的应用。本文首次就cps基因的基本属性、转录调节、编码蛋白及其生物功能、对荚膜多糖合成的调控机理、在血清分型和突变株构建的应用这六个方面进行深入分析和讨论,以期为GBScps基因的新功能研究和创新应用提供理论参考。

罗非鱼主要疾病介绍与防治技术(二)

4.链球菌病（Streptococcusis） 链球菌（Streptococcus）是全球公认的罗非鱼养殖产业中危害最严重的病原菌,它能导致罗非鱼大规模的发病死亡,引起巨大的经济损失。

一例大鲵腐皮病的诊断与防治

近年来，大鲵腹胀病、腐皮病、烂脚病、溃疡病等病害成为威胁大鲵健康养殖的不利因素，给广大养殖户带来困扰。本文对2011年12月四川某特种养殖场饲养的大鲵出现后肢皮肤发白、腐皮溃烂为主要症状的疾病进行了病原学诊断，并制定了相应防治方案，现将有关情况小结如下，以期为更多的养殖者提供参考经验。

海豚链球菌C5a肽酶功能活性区域表达及其对斑点叉尾鱼回(Ictaluruspunctatus)的免疫保护作用

本研究对海豚链球菌DGX07株C5a肽酶基因序列进行了克隆和生物信息学分析,表达了其功能活性区域,并以斑点叉尾(鱼回)(Ictalurus punctatus)作为受试动物,对该蛋白进行了免疫保护作用研究。结果显示,scpⅠ基因编码的氨基酸序列具有2个Peptidase_S8_S53超家族的保守结构域,1个PA超家族的保守结构域和1个Fn3-like超家族的保守结构域,推导其活性位点共有7个,位于前501个氨基酸;根据二级结构预测、疏水性分析、表面可及性、柔性分析和抗原表位分析,推断该氨基酸序列的B细胞表位区域主要集中在第67—1098个氨基酸之间。因此,本研究选取去掉信号肽的N段的前635个氨基酸(180—2085bp)进行表达。使用表达的重组蛋白pSCPⅠ免疫斑点叉尾,抗体效价结果显示:免疫后第四周抗体效价最高,第五周后抗体效价开始下降,相对免疫保护率为43.75%。以上结果表明重组pSCPⅠ蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。

斑点叉尾源海豚链球菌DGX07株simA基因克隆、鉴定及分子特性分析

以Primer p14(5'-GATCAAGTCC-3')为引物对分离自患病斑点叉尾海豚链球菌强毒株DGX07进行RAPD分析。同时参照GenBank中海豚链球菌simA基因序列设计特异性引物,以DGX07基因组DNA为模板,扩增出约1 500 bp的simA基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行PCR和双酶切(BamHⅠ+XhoⅠ)鉴定,鉴定正确后送测序公司测序。RAPD分析结果显示,DGX07和标准菌株均能扩增出750 bp大小的条带。通过生物信息学软件对测序结果分析显示,simA基因全长1 566 bp,由521个氨基酸组成,与海豚链球菌simA和simB亲缘性达100%,存在1个由41个氨基酸组成的信号肽,具有Bap31和Gram_pos_anchor两个超家族的保守结构域;具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点22个和N-糖基化位点2个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,是一种膜外蛋白,并具有多个抗原优势位点区域。密码子偏爱性分析表明,斑点叉尾源海豚链球菌simA基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性与酵母较为接近。获得GenBank登录号为JF330100。

南方鲇锥体虫病的病理诊断与防治

近年来，随着南方鲇集约化养殖的发展，各种疾病也频频暴发，给南方鲇养殖业带来严重的经济损失，其中锥体虫病的不断发生和由此导致的经济损失的增大，已成为南方鲇养殖中一个不容忽视的问题。1997年5月，四川仁寿县黑龙滩水库水产养殖公司网箱养殖的南方鲇暴发疾病，发病率80％，死亡率30％，经笔者前往发病现场进行采样和诊断，确诊该养殖区南方鲇发病死亡由锥体虫感染所致。之后，2011年6月四川省双流县池塘养殖南方鲇也陆续出现不明原因的死亡，笔者受邀到现场调查和诊断，发现病状与1997年四川仁寿县黑龙滩水库网箱养殖的病鲇相似，鱼体外观除个别区域有小的出血性损伤外，其他无明显异常变化，但每天均有较多的鲇发生死亡，据了解他们曾用过大量的抗生素、中草药、驱虫药、微生态制剂及其他消毒调水剂等均不见效。笔者经过仔细的调研后，决定随机抽取部分南方鲇采血进行血涂片检查。结果在绝大多数血涂片上观察到大量活跃的锥体虫，说明这次南方鲇发病死亡的病原仍为锥体虫。现将在以上两例南方鲇锥体虫病的实际诊疗情况的基础上结合一些相关资料，向广大基层水产工作者和养殖户提供对该病诊断和防治的一些参考。

罗非鱼主要疾病介绍与防治技术(三)

8.柱形病（Columnaris） 病原：柱形病是危害罗非鱼养殖的主要病害之一。柱形病的病原为柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）,是一种严格需氧的革兰氏阴性菌,菌体呈细长弯曲的柱状,具有滑动能力和团聚性,

MS-222对斑点叉尾鮰麻醉效果的研究

为研究各种因素对MS-222麻醉效果的影响，进行了不同麻醉剂质量分数、麻醉温度和药浴时间等对斑点叉尾鲴[（100±8．5）g]麻醉效果的试验。试验结果：在水温26℃条件下，MS-222质量分数在40—160mg·L-1时，随着质量分数的增大，斑点叉尾鲴进入麻醉状态的时间显著缩短，复苏时间变化较小，MS-222质量分数在100～160mg·L。时能够达到理想的麻醉效果。当MS-222质量分数为100mg·L-1，水温在18～34℃时，随着温度的升高，斑点又尾鲴进入麻醉状态的时间显著缩短，复苏时间明显增加，水温在26—30℃时能够达到理想的麻醉效果。水温26℃条件下，当MS-222质量分数小于等于60mg·L-1时，斑点叉尾鲴的麻醉时间较长；Ms-222质量分数为80mg·L-1和100mg·L-1时，斑点又尾鲴的麻醉时间不能超过10min；MS-222质量分数在大于等于120mg·L-1时，斑点叉尾鲴的麻醉时间不能超过3min。用不同质量分数的MS-222对斑点叉尾鲴进行麻醉时，斑点叉尾鲴每分钟呼吸频率到达峰值的时间随着麻醉剂质量分数的增大而逐渐缩短。

迪康凝胶和康惠尔清创胶治疗大鼠烫伤创面效果研究

目的研究迪康凝胶和康惠尔清创胶对大鼠烫伤创面的治疗效果。方法将SD大鼠随机分为模型组、康惠尔清创胶组和迪康凝胶组,均造背部深Ⅱ度烫伤。两药物组连续治疗21天,每天1次,模型组自然愈合。考察创面皮肤的愈合效果,检测皮肤组织IL-8、TNF-α、胶原Ⅰ型、Ⅲ型及血清EGF含量以及组织IL-8、TNF-α表达水平。结果迪康凝胶可有效修复损伤组织,促进真皮生长,促进创面愈合;较模型组,可明显降低创面皮肤组织TNF-α和IL-8(P<0.05,P<0.01),提高Ⅰ、Ⅲ型胶原含量(P<0.05,P<0.01),明显提升血清EGF(P<0.05);各组TNF-α和IL-8的mRNA表达水平均与其组织含量水平基本一致。迪康凝胶和康惠尔清创胶相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论迪康凝胶能有效促进大鼠皮肤烫伤创面的愈合。

miRNA通过Mcl-1基因调控HBV阳性肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性

目的:探讨干预HBV阳性肝癌细胞相关miRNAs对肝癌细胞索拉菲尼敏感性的影响。方法:qPCR检测HepG2.2.15(HBV阳性)和HepG2.vc(HBV阴性)肝癌细胞中miR-29、miR-101和miR-193b的表达,以HepG2.2.15细胞中低表达的miRNA合成相应的miRNA mimics,并将目标miRNA mimics分别转染至HepG2.2.15和HepG2.vc细胞;qPCR检测两种细胞中目标miRNA表达,Western blotting检测目标miRNA mimics转染前后Mcl-1蛋白表达。同时分别向转染和非转染的HepG2.2.15和HepG2.vc细胞中分别加入(1×10^(-9))^(1×10^(-3))mol/L的索拉菲尼,72 h后测定索加菲尼对细胞作用的IC_(50)值和细胞凋亡率。结果:与HepG2.vc细胞比较,HepG2.2.15细胞中miR-193b的表达显著降低(P<0.05);与miR-193b mimics转染前比较,HepG2.2.15和HepG2.vc细胞中miR-193b的表达均有显著升高(P<0.05)。与HepG2.vc细胞比较,HepG2.2.15细胞中Mcl-1蛋白表达显著增高(P<0.05);miR-193b mimics转染后,HepG2.2.15和HepG2.vc细胞中Mcl-1蛋白表达较两者转染前均有显著降低(P<0.05);miR-193b mimics转染后,索拉菲尼可显著增加两组细胞的凋亡率(P<0.01),同时其对两组细胞作用的IC_(50)值显著降低[HepG2.2.15细胞:(0.215±0.028)vs(0.391±0.025)mol/L,HepG2.vc细胞:(0.315±0.027)vs(0.654±0.019)mol/L;均P<0.01]。结论:HBV相关肝癌细胞中miR-193b的低表达可能是癌细胞对索拉菲尼敏感性降低的原因,Mcl-1可能为miR-193b的靶点,miR-193b mimics与索拉菲尼具有显著协同作用。

迪康凝胶对大鼠烫伤创面的治疗作用及可能机制研究

目的探讨迪康凝胶对烫伤大鼠创面愈合的效果及作用机制。方法将SD大鼠随机分为模型组、美宝烫伤膏组、迪康凝胶组,3组均采用超级控温烫伤仪,造背部深Ⅱ度烫伤。模型组不给药,其余给药1次/d,连续21d。连续考察21d内创面愈合情况及创面病理组织形态。ELISA法检测组织TNF-α和IL-8及Ⅰ、Ⅲ型胶原。RT-PCR检测组织TNF-α和IL-8表达水平。结果与模型组比较,迪康凝胶组愈合时间缩短(P<0.05,P<0.01),创伤愈合率增高(P<0.05,P<0.01),差异有统计学意义。组织学观察证明,迪康凝胶具有良好的组织损伤修复作用。ELISA检测表明,烫伤后两药物组创面组织TNF-α和IL-8含量均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01);而胶原Ⅰ、Ⅲ组织含量均高于模型组。RT-PCR检测表明,两药物组组织TNF-αmRNA和IL-8mRNA表达水平均与其蛋白浓度水平基本一致。结论迪康凝胶能促进大鼠皮肤烫伤后创面愈合,是治疗烫伤创面的有效药物。

我国渔药研究的现状与建议

针对国内渔药的研究和开发,介绍了相关的政策与法规,简述了渔药药学、药理毒理学的研究现状,根据渔药开发中存在的一些问题,提出应加大制剂和剂型的研究力度,建议从养殖水环境中药物稳定性、药物对水产动物应激作用、药物残留和水污染风险评估等方向开发泼洒型渔药,从处方设计上提高水产动物对药物的顺应性,依据水产动物生活习性对药物的浮性与沉性进行设计等方向开发口服型渔药,提高推广应用的可行性;建议加大预防用药和疾病快速诊断方法的研究力度,做到"以防为主,快诊早治,合理用药"。

胶体金标记兔抗-维氏气单胞菌Lam B多克隆抗体的制备与优化

文章旨在开发一种适用于组装维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)胶体金快速检测试纸条的胶体金标记抗体。试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,按柠檬酸三钠加入体积(75、 100、 150、 200μL)分为1~4组,作为试验组,另设空白对照组。5支试管混合液分别水浴加热后肉眼观察胶体金颜色,计算胶体金粒径,进行抗体标记浓度筛选和pH优化。结果显示,组别3胶体金的颜色呈酒红色,最大吸收波长为524nm,胶体金粒径为22.10nm,符合胶体金最佳标准。当兔抗-Lam B抗体的加入浓度为7μg/μL, pH为8.5时具有最大吸光度为0.6439。可见,该研究胶体金标记兔抗-维氏气单胞菌Lam B多克隆抗体制备中柠檬酸三钠与氯化金四水合物的最佳比例为150μL:10mL,兔抗-Lam B多克隆抗体的最佳浓度为7μg/μL,反应体系最佳pH为8.5。