细胞穿透肽在肿瘤治疗中的应用

随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的入胞转运方式如电穿孔、脂质体转染等均存在对细胞的额外毒副作用,且作用范围局限于体外实验。细胞穿透肽是一类以非受体依赖方式,非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽。它们可以与多种生物活性物质连接并携带其进入细胞,这一特性为它们成为理想的药物载体提供了可能。本文对使用细胞穿透肽作为载体转运具有抗癌作用的生物大分子进入细胞的抗癌实验予以介绍。

蝎毒抗肿瘤有效成分SVⅡ-A4的提纯及抑瘤活性观察

目的:分离纯化东亚钳蝎原毒,提取活性多肽成分SVⅡ-A4,并观察其抑瘤活性。方法:(1)分离纯化,采用分子筛凝胶柱层析和离子交换柱层析分离纯化蝎毒;(2)纯度分析,用SDS-PAGE电泳和HPLC色谱法对SVⅡ-A4进行纯度分析;(3)活性观察,用MTT法(酶反应比色法)观察比较不同浓度(1、10、100 mg/L)的蝎毒及其成分与SVⅡ-A4对4种肿瘤细胞(A549、HL-60、K562/S及K562/ADR)的抑制作用。结果:经过两步的分离纯化获得5个蝎毒多肽成分,其中的蝎毒抗肿瘤有效成分SVⅡ-A4对4种肿瘤细胞的抑制作用与阳性对照组相当。结论:经过优化提纯方法,两步即可从东亚钳蝎原毒中获得色谱纯度达96.73%的抑瘤活性单体成分SVⅡ-A4,初步观察,SVⅡ-A4对4种肿瘤细胞均显示出明显的抑制作用及一定的剂量-效应关系,而且它对布耐药细胞株(K562/ADR)的抑制作用较阳性对照组强有进一步开发利用的价值。

蝎毒抗癌组分SVⅡ分离法的优化研究

目的比较三种柱径的分子筛G-50凝胶层析柱分离东亚钳蝎蝎毒的柱效;并对分离所得组分作MTT(酶反应比色法)抗肿瘤活性作用研究,为从中研制和开发出高效、低毒的新型抗癌特效药筛选出目标组分。方法(1)采用三种规格的分子筛层析柱分离蝎毒;(2)HPLC色谱分析比较各组分的指纹图谱;(3)MTT法观察不同浓度(1、10、100 mg/L)的蝎毒及其组分对四种肿瘤细胞(HL-60、A549、K562/ADR、K562/S等)的毒性作用。结果经过分子筛柱层析,可从蝎毒(Scorpion venom,SV)获取三个组分SVⅠ、SVⅡ、SVⅢ;经HPLC色谱分析,各组分明显含有四种以上单体成分;MTT法研究表明,SVⅡ对四种肿瘤细胞的细胞毒性较原毒强,剂量-效应关系较好,而SVⅠ、SVⅢ对四种肿瘤细胞抑制作用不明显。结论(1)利用大柱径的层析柱分离蝎毒的柱效较高;(2)组分SVⅡ是蝎毒抗癌的目标组分,且其对耐药细胞株(K562/ADR)的抑制作用比阳性对照组强,有待进一步的分离纯化,筛选出色谱纯的抗癌活性成分(多肽单体)。

眼镜蛇毒直接溶解因子对人肝癌细胞株H_(7402)产生NO和LPO的影响

目的：研究眼镜蛇毒直接溶解因子（ＤＬＦ）对人肝癌细胞株Ｈ７４０２产生一氧化氮（ＮＯ）和脂质过氧化物（ＬＰＯ）的影响。结果：ＤＬＦ对体外培养的Ｈ７４０２细胞有杀伤作用，ＩＣ５０为２４７ｍｇ·Ｌ－１，ＤＬＦ与Ｈ７４０２细胞的生长抑制率呈量效关系。ＤＬＦ可介导Ｈ７４０２细胞产生大量ＮＯ２，ＮＯ２量与ＤＬＦ的剂量呈量效关系。在一定剂量范围内ＮＯ２量与Ｈ７４０２的生长抑制率呈显著正相关。用５７０型粘附式细胞仪测定单个细胞内ＬＰＯ，发现ＤＬＦ可使Ｈ７４０２细胞内ＬＰＯ产生增加。结论：ＤＬＦ可杀伤Ｈ７４０２细胞，其部分机制可能是通过诱导肿瘤细胞产生ＮＯ和ＬＰＯ。

卵黄抗体用于蛇毒抗原检测的初步研究

目的在常规ELISA检测中,以卵黄抗体取代哺乳动物来源的IgG类抗体,以探讨卵黄抗体应用于蛇毒检测的可行性.方法以甲醛减毒的眼镜王蛇毒抗原免疫莱航母鸡,制备抗眼镜王蛇毒抗体;采用过碘酸钠法对特异卵黄抗体进行酶标;将卵黄抗体及相应酶标抗体应用于常规ELISA中,对国内常见蛇毒样品抗原(包括眼镜王蛇毒、眼镜蛇毒、金环蛇毒、银环蛇毒、五步蛇毒及广东园斑蝰蛇毒)进行检测,并进行灵敏度、精确度、特异性及交叉反应等分析.结果检测的灵敏度可达32 μg·L-1,并且眼镜王蛇毒抗原浓度在32～750 μg·L-1的范围内,线性关系较好(r=0.963);初步应用表明卵黄抗体对眼镜王蛇毒具有较高的特异性,与蝰蛇科的五步蛇毒、园斑蝰蛇毒无交叉反应,与眼镜蛇科的金环及银环蛇毒仅在高剂量(剂量大于500 μg·L-1)时存在轻度交叉反应,不干扰实验检测,但与眼镜蛇毒之间交叉反应明显,干扰实验检测;应用本方法对低(100 μg·L-1)、中(300 μg·L-1)、高(1 000 μg·L-1)不同浓度的眼镜王蛇毒样品检测,结果平均板内变异系数均在1%～3%之内,板间变异系数在8%以内.结论 特异的卵黄抗体应用于微量蛇毒检测研究是可行的,具有灵敏度高、特异性较强等优点.该研究将为蛇伤诊断试剂盒的研制提供相应的理论依据.

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌

目的探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性。方法20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒+超声组(P+U)、质粒+微泡组(P+M)和质粒+超声+微泡组(P+U+M)共4组进行实验。选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况。结果P、P+ M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P+U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P+M组明显增强(P<0.05),P+U+M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P+M组的10倍,P+U组的3倍(P<0.05);P+U+M组转染率为(42.72±10.07)%较之P+U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05)。结论超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一。

抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体的制备

目的 研制抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体 ,并研究该抗体在鸡卵黄中表达过程。方法 以甲醛减毒处理的眼镜王蛇粗毒免疫莱航母鸡 ,母鸡免疫应答后 ,在卵黄中产生抗眼镜王蛇毒抗体 ,应用嗜硫色谱柱HiTrapIgYPurificationHP从鸡卵黄中提取抗眼镜王蛇毒抗体 ;以间接ELISA法及双向免疫抗散法测定抗体的效价、特异性及免疫活性 ;采用福林酚法测定蛋白含量 ;采用SDS PAGE法测定分子量及鉴定抗体纯度 ;抗体的特异性及交叉反应采用酶联免疫吸附法进行进行验证。结果 母鸡初次免疫第 9天即有抗体产生 ,初次免疫 6 0天后抗体效价超过 10 5;卵黄抗体经嗜硫色谱柱纯化后 ,经SDS PAGE检测为电泳纯 ,纯化后抗体效价较纯化前提高 4倍 ,每枚蛋中平均可获得较纯抗体 97 5mg ;所获取的抗体具有高度特异性 ,与蝰蛇科属的其它蛇毒无交叉反应 ,与眼镜蛇科蛇毒存在不同程度交叉反应 (蛇毒浓度大于5 0 0 μg·L-1时明显 )。结论 本研究首次研制并鉴定了抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体 ,开拓了我国蛇伤治疗的新领域 ,并分析抗体在产蛋期卵黄液中表达的进度 ,为今后该抗体的持续、高质量诱导奠定基础 ,同时也促进其它抗蛇毒鸡卵黄抗体的研究开发及蛇毒单克隆抗体的研制。

中华眼镜蛇毒活性组分体外抑制三维血管生成的实验研究

目的研究中华眼镜蛇毒活性组分的抗血管生成作用。方法采用拟血管生成三维培养法,观察活性组分对体外血管生成的抑制效应。结果活性组分可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管网状三维结构的反应,0.6、1.2、2.4μg·ml-1的不同浓度组分抑制程度不同。在0.6μg·ml-1浓度组,培养基质Matrigel中的内皮细胞团只形成局部的、不完整的空间网状结构;在1.2μg·ml-1浓度组,悬浮于凝胶中的细胞团所形成的管芽不能相互连接而形成空间网状结构;在2.4μg·ml-1浓度组,细胞散在悬浮于胶层中大部分不能粘聚,且随培养时间的延长无明显的结构变化。结论中华眼镜蛇毒活性组分具有体外抑制血管生成的生物活性。

中华眼镜蛇毒组分F的体外抗血管生成活性研究

目的研究中华眼镜蛇毒组分F对血管内皮细胞黏附功能的抑制作用和体外的抗血管生成活性。方法MTT快速测定法测定组分F对原代培养的血管内皮细胞对纤维蛋白原(Fg)、纤连蛋白(Fn)、Matrigel的黏附作用的影响;采用平面拟毛细血管生成培养法,观察组分F对血管生成的抑制效应。结果组分F可抑制血管内皮细胞的黏附功能,对细胞黏附Fn、Fg和Matrigel 3种物质的作用从1.2μg/ml浓度起即有抑制效应(P<0.05),且均呈浓度依赖性,组分F对细胞黏附Fg和Matrigel的抑制作用较其对Fn的作用强(P<0.05);组分F可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管样网状结构的反应,并且随浓度的不同抑制程度有明显不同。结论中华眼镜蛇毒组分F具有体外抗血管生成活性。

蝎毒多肽促进创伤皮肤溃疡愈合的实验研究

目的研究蝎毒多肽促进皮肤溃疡愈合的作用及其机制。方法 NIH小鼠60只,采用创伤溃疡模型,分成五组,分别为外用无菌生理盐水组(空白组)、外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,贝复济)组(150 AU/cm2)、蝎毒多肽高、中、低浓度治疗组(4×10-3、4×10-4、4×10-5mg/mL),给药的3、5、7、9 d测量创面面积,计算溃疡愈合率;采用液体试管法和琼脂稀释法观察体外抑菌作用。结果随给药时间延长,蝎毒多肽治疗组溃疡愈合率逐渐升高,与空白组比较,差异有统计学意义;蝎毒多肽对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.125 0 mg/mL。结论蝎毒多肽具有促进皮肤溃疡愈合及体外抑菌的作用。

人CAT启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定

目的构建人过氧化氢酶(CAT)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为进一步研究CAT表达调控奠定基础。方法以人类基因组DNA为模板,PCR获得-404～+16大小的启动子片段,将其定向插入pDsRed1-1载体,构建pDsRed-CATp红色荧光蛋白报告基因载体。瞬时转染NIH/3T3细胞,观察CAT启动子对H2O2刺激的反应。结果pDsRed-CATp经双酶切及DNA测序分析鉴定准确无误;该载体瞬时转染NIH/3T3细胞,静息状态呈现弱转录,H2O2刺激后,转录水平明显增强。结论成功构建CAT启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,对H2O2刺激反应良好,为研究CAT基因表达调控提供了有效的工具。

人铜锌超氧化物歧化酶基因启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体的构建及表达

目的构建人铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn-SOD,SOD1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,并对其功能进行鉴定,为研究细胞内SOD1基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具。方法提取人基因组DNA,PCR扩增SOD1 5′非编码区启动子序列(-1 499-+17);采用基因重组技术构建由SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,将该载体瞬时转染Hella细胞,观察静息或佛波酯(PMA)刺激下红色荧光蛋白表达,以检测SOD1启动子的转录活性及其基因表达。结果酶切和DNA测序证明所构建红色荧光蛋白报告基因载体正确;该表达载体静息状态下在Hella细胞表达少量红色荧光蛋白,经PMA刺激后,能够表达较多高亮度的红色荧光蛋白。结论成功构建了SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,其对相关刺激有很好的反应,可用于SOD1基因表达信号调控机制的研究。

眼镜蛇毒C组分对白血病细胞中基质金属蛋白酶-2、9表达的影响

目的探讨眼镜蛇毒C组分对白血病细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达和活性的影响。方法用10 ng/mL的眼镜蛇毒C组分对白血病细胞进行0、12、24、48 h处理。用ELISA、明胶酶谱法和荧光RT-PCR法检测不同时间处理后白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达水平。结果与处理0 h相比,白血病细胞经10 ng/mL的眼镜蛇毒C组分分别处理12、24、48 h后,用ELISA检测结果显示MMP-2、MMP-9活性下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);明胶酶谱法检测结果显示MMP-2、MMP-9活性下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);荧光定量RT-PCR检测结果显示,MMP-2、MMP-9 mRNA相对含量下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 10 ng/mL眼镜蛇毒C组分对白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达均有抑制作用,眼镜蛇毒C组分对白血病细胞的抑制作用可能与其抑制MMP-2和MMP-9表达和活性相关。

人FAT10蛋白过表达诱导饥饿状态下HEK 293细胞发生凋亡

目的:采用flag标记的人FAT10蛋白研究人FAT10蛋白对HEK293细胞的影响。方法:将FAT10基因片段克隆到载体pcDNA3-flag上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测外源性FAT10正常培养状态和饥饿状态下的HEK293细胞中的表达情况;并用XTT法和DNA ladder法观察正常培养和饥饿状态下HEK293细胞的凋亡情况。结果:重组质粒在HEK293细胞中高效表达,但在正常培养状态下和饥饿状态下表达情况不同。饥饿状态下,过表达FAT10的HEK293细胞存活率显著低于对照细胞,并且出现DNA ladder现象。结论:成功构建了带Flag标签的FAT10真核表达质粒,可在HEK293细胞中高效表达;FAT10过表达促进饥饿状态的HEK293细胞发生凋亡。

国产蛇毒激活血浆蛋白C的研究

目的 :从 9种国产蛇毒中筛选具有激活血浆蛋白C作用的蛇毒。方法 :运用活化部分凝血活酶时间(APTT)和发色底物实验分别观察抗凝活性和酰胺酶活性 ,综合抗凝活性和酰胺酶活性确定蛋白C蛇毒激活作用。结果 :在 9种国产蛇毒中烙铁头蛇毒及蝮蛇毒在 1 5mg/L浓度下即使人血浆纯蛋白C产生酰胺酶活性 ,并使APTT显著延长。结论 :9种国产蛇毒中烙铁头蛇毒及蝮蛇毒具有激活人体血浆蛋白C成为活化蛋白C(APC)

东亚钳蝎钙通道样毒素的重组表达及活性研究

目的:原核表达东亚钳蝎钙通道样毒素,分离纯化并初步探讨其生物学活性。方法:将东亚钳蝎钙通道样毒素Bm Ca基因重组到PET-GST表达载体中,转化入大肠杆菌BL21并IPTG诱导表达,Ni-Super Chelating Resin柱亲和层析纯化融合蛋白,尿素梯度透析法复性融合蛋白,采用激光共聚焦显微镜观察其对大鼠骨骼肌细胞内钙浓度的影响。结果:成功构建PET-GST-Bm Ca原核表达质粒,诱导后表达分子量约为33 k D的融合蛋白,经亲和层析得较高纯度的融合蛋白,复性后激光共聚焦扫描显微镜检测显示表明重组蛋白能可逆性的升高骨骼肌细胞内[Ca2+]i。结论:成功构建PET-GST-Bm Ca重组质粒,获得Bm Ca基因工程菌株,并表达纯化得到可作用于钙通道的重组蝎毒素蛋白。

精制抗金环蛇毒血清治疗金环蛇咬伤61例

采用国产精制抗金环蛇毒血清静脉滴注治疗金环蛇咬伤６１例（轻型５２例，重型９例）。结果：轻型患者经０．５～１．５天治疗，平均住院０．８２±０．６９天痊愈；重型患者平均住院２．６５±１．５４天（最长住院＜７天），痊愈出院。及早使用抗毒血清既能减轻病情，又可缩短住院时间。说明精制抗金环蛇毒血清是治疗金环蛇咬伤的高效、速效和安全的急救首选药。

卵黄中蝮蛇蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用

目的 :制备特异性高的蝮蛇蛇毒卵黄抗体 ,并对其体内保护和体外保护作用进行了研究。方法 :用蝮蛇蛇毒作为抗原免疫鸡 ,使之在蛋黄中产生抗体IgY ,然后用聚乙二醇法提取IgY ,并通过小鼠体内保护和体外中和试验 ,研究IgY对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用。结果 :通过本法制得的IgY在体内和体外试验中都能中和蝮蛇蛇毒 ,对蝮蛇蛇毒急性中毒的小鼠有明显的保护作用。结论 :聚乙二醇法从免疫鸡蛋黄中提取的蛇毒抗体IgY 。

国产蝮蛇毒蛋白C活化组份的分离提取及生物学活性鉴定

目的：从国产蝮蛇毒中分离提取蛋白C活化组份。方法：以江浙蝮蛇毒为材料，经DEAE－SephadexA－50、CM－SephadexG-25二次柱层析，分离提取蛋白组份，并用KlPTT法及发包庇物法检测其抗凝活性及酰胺酶活性。结果：经二次柱层析，分离出了FⅥ-Ⅲ蛋白组份，经生物学活性鉴定表明，该组份具有强烈的抗凝血活性及酰胺酶活性，同时观察不同浓度FⅥ-Ⅲ组份对正常血浆KFPTT值及A405值的影响，发现KPTT值随FⅥ-Ⅲ组份浓度的增加而升高，两者呈正相关，A405值也与该组份有显著量效关系，表明我们分离提取的蛇毒组份FⅥ-Ⅲ具有抗凝活性，并且该活性与蛋白C的活化有关。

印度农村金融体系建设中的政府干预

将印度农村金融体系建设与中国及其他发展中国家相比较,介绍了印度农村金融体系的相关机构及其功能,说明了印度农村金融体系建设过程中政府的干预作用,并从利弊两方面分析了政府干预措施的得失,总结了政府干预对印度农村金融发展的影响及启示意义。