HSV-TK/CD基因联合IL-12基因体内治疗肝癌

目的 观察HSV-TK／CD基因联合IL-12基因体内治疗肝癌的疗效。方法 SCID小鼠双侧腋部皮下植入5×105(0.2ml)HepG2细胞,同时腹腔注射PBL 2×107(0.5 ml)。荷瘤小鼠分为4组,左侧腋部瘤内分别注射5×105(0.1 ml)丝裂霉素处理过的HepG2-IL-12细胞、5×105(0.1 ml)HepG2-pALBeAFP-CD／TK细胞或两者(各0.05 ml).次日起腹腔注射PBS或GCV 100 mg／kg+5-FC 500 mg／kg,连续10天。Ⅰ组:HepG2-IL-12+GCV,5-FC;Ⅱ组:HepG2-pALBeAFP-CD／TK+PBS;Ⅲ组:HepG2-pALBeAFP-CD／TK+GCV,5-FC;Ⅳ组:HepG2-pALBeAFP-CD／TK+HepG2-IL-12+GCV,5-FC。治疗结束5天后作常规肿瘤组织病理学检查。结果 与Ⅱ组比较,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组治疗侧均有明显的生长抑制,第30天较Ⅱ组分别减小20.5％、54.9％和87.6％.且Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组之间差异明显。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组右侧肿瘤较Ⅱ组同侧显著缩小,分别达23.2％、24.9％和45.0％。结论 pALBeAFP-CD／TK双自杀基因体内治疗肝癌有效。在免疫活性鼠,局部转染IL-12基因可增强双自杀基因的疗效和远处旁观者效应。

95例SARS患者细胞免疫功能抑制的特点及其原因

用ELISA方法测定95例SARS患者急性期、恢复期血清细胞因子水平,用流式细胞仪检测该组患者急性期、恢复期淋巴细胞亚群,并分析细胞因子水平和淋巴细胞亚群变化的关系。结果发现,IL-10和TGF-β在观察期(急性期和恢复期)持续升高,急性期CD4+和CD8+T细胞显著减少,恢复期患者外周血CD8+记忆T细胞减少36.78%。IL-10和TGF-β升高与淋巴细胞变化具有统计学相关。结果提示,SARS病毒感染抑制宿主的细胞免疫功能,引起急性期CD4+和CD8+T细胞显著降低和恢复期的免疫记忆细胞减少。而IL-10和TGF-β过表达可能在SARS免疫病理中起重要作用。

肝癌特异性HSV-TK/CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性

【目的】构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒。【方法】用平端连接方法将pUH-3质粒中822 bp的pALBeAFP片段(含有416 bp的白蛋白启动子pALB和406 bp的甲胎蛋白增强子eAFP)代替pCEA—CD/TK质粒的CEA启动子,用PCR法鉴定插入方向,构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒pALBeAFP-CD/TK。将pALBeAFP-CD/TK转染HepG2等4种肝癌细胞,MTT法测定前药GCV、5-FC对HepG2细胞的杀伤作用。【结果】获得pALBeAFP—CD/TK克隆,RT-PCR证实HepG2细胞转染pALBeAFP-CD/TK后可表达自杀基因, pALBeAFP—CD/TK转染可使前药GCV、5-FC特异性地杀伤HepG2细胞。【结论】肝癌特异性HSV—TK/CD基因表达质粒构建成功。

B7-1分子诱导体外抗肝癌免疫反应

目的：了解Ｂ７分子在体外抗肝癌免疫中的作用。方法：健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）与ＨｅｐＧ２／ｈＢ７－１。ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ及亲代ＨｅｐＧ２瘤苗混合培养（ＭＬＴＣ），检测淋巴细胞活化增殖能力，淋巴细胞ＨＬＡ－１类抗原的表达，培养上清ＩＦＮ－γ水平、ＴＮＦ活性及ＬＡＫ、ＣＴＬ细胞活性。结果：ＨｅｐＧ２／ｈＢ７－１瘤苗促淋巴细胞增殖最高达１４．６倍，明显高于ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ和ＨｅｐＧ２瘤苗的作用（Ｐ＜０．０５）。ＨｅｐＧ２／ｈＢ７－１瘤苗刺激后淋巴细胞ＨＬＡ－Ｉ类抗原表达、ＩＦＮ－γ及ＴＮＦ分泌均高于ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ、ＨｅｐＧ２瘤苗刺激组。Ｅ／Ｔ＝４０：１时ＬＡＫ细胞对ＨｅｐＧ２／ｈＢ７－１细胞的杀伤率为杀伤ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ和ＨｅｏｐＧ２胞的２．０，２．４倍；ＣＴＬ细胞对ＨｅｐＧ２／ｈＢ７－１细胞杀伤为对ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ及ＨｅｐＧ２杀伤的２．７倍，具有明显差异（Ｐ＜０．００１）。结论：抗肝癌免疫中Ｔ细胞活化也需双信号共刺激。Ｂ７－１分子能诱导体外抗肝癌免疫反应。

B7-1分子增强NK细胞对肝癌细胞毒活性的体外研究

目的：了解Ｂ７１ 分子在体外抗肝癌免疫反应中对自然杀伤细胞（ＮＫ 细胞） 杀伤活性的影响。方法：经脂质体ＤＯＳＰＥＲ 介导将ｈＢ７１ 基因直接导入ＨｅｐＧ２ 细胞，建立ＨｅｐＧ２／ｈＢ７１ 细胞克隆。分离健康人和肝癌患者外周血淋巴细胞，以ＭＴＴ 法测定ＮＫ 细胞对ＨｅｐＧ２／ｈＢ７１ 细胞的杀伤活性，以杀伤ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ 和ＨｅｐＧ２ 细胞为对照。结果： ＨｅｐＧ２ 细胞转染ｈＢ７１ 基因后表达Ｂ７１ 分子。无论在健康人组还是肝癌患者组， 健康人外周血ＮＫ 细胞杀伤ＨｅｐＧ２／ ｎｅｏ ， ＨｅｐＧ２ 细胞的活性约为肝癌患者ＮＫ 活性水平的２ 倍。健康人和肝癌患者外周血ＮＫ 细胞对ＨｅｐＧ２／ｈＢ７１ 细胞的杀伤活性均较对照组明显增高（ 增强１－４９～３－４８ 倍） ， 对ＨｅｐＧ２／ ｈＢ７１ 细胞的杀伤活性在Ｅ／ Ｔ＝ ５ ∶１时分别为５７－２ 及４３－８ ，有显著性差异（ Ｐ＜ ０－０５） ，在Ｅ／Ｔ＝ １０ ∶１ 及２０ ∶１ 时分别可达８２－８ ～８４－４ 和７８－６ ～８６－４ ，差异不显著（ Ｐ ＞ ０－０５） 。结论：Ｂ７１ 分子显著增强ＮＫ 细胞对肝癌细胞的体外杀伤活性，可能通过激活非特异性细胞免疫在抗肝癌复发中发挥作用。

95例SARS患者的Th2细胞因子反应及其临床意义

本研究共收集95例罹患严重急性呼吸综合征(SARS)的医护人员的急性期和恢复期血清,用ELISA方法测定血清中白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子β(TNF β)以及转化生长因子β(TGF-β)水平,用流式细胞仪测定急性期患者外周血CD4+和CD8+T细胞比例.结果显示,SARS患者病程初、中期血清IFN-γ无明显改变;IL-2在起病2月内无显著变化,但在病程3～5个月时降低;IL-4在健康对照和患者均未能测出;TNF-β在SARS感染的1周内和病程第2个月内下降.与上述细胞因子形成对比,患者IL-10以及TGF-β均在发病起即持续升高直至整个病程.这些细胞因子的变化均与激素的使用无关(P＞0.05).SARS患者急性期CD4+T细胞和CD8+T细胞急剧减少.可见,SARS相关冠状病毒感染可引起Th2细胞因子反应,可能损害患者的细胞免疫功能而促进体液免疫,IL-10和TGF-β可能在SARS的发病中起作用.

肝移植术后的营养治疗

目的探讨肝移植术后的营养治疗方法。方法对11例肝移植病人术后的营养治疗方法和营养状况进行回顾性分析。术后1～3天采用全肠外营养(TPN),辅以人白蛋白、血浆;术后4～5天肠内营养(EN)结合肠外营养(PN);术后6～10天逐渐过渡到全肠内营养;术后12～18天完全经口进食。术后常规使用重组人生长激素rhGH4～7天。结果除2例病人分别死于脑出血、呼吸衰竭外,余9例恢复顺利。结论适当的营养治疗有利于肝移植病人的术后恢复。

腺病毒携带的人内皮抑素基因(Ad/hEnd)抑制人舌鳞状细胞癌生长的研究

背景与目的:舌癌是口腔常见的恶性肿瘤,目前常规采用以手术为主结合放疗化疗的综合治疗,总体的5年生存率只有50％左右,抗肿瘤血管生成治疗已 成为舌癌治疗的研究方向之一。本实验以5型E1缺陷型腺病毒携带的人内皮抑素基因(Ad/hEnd)感染舌癌细胞(Tca8113)和人脐静脉内皮细胞株(ECV),并对荷瘤裸鼠舌癌的抑瘤效果进行观察,研究其在舌癌细胞中的表达及对舌癌抑制作用。方法:(1)免疫组化法检测内皮抑素蛋白在Tca8113细胞和ECV细胞中的表达及分布。ELISA法检测上清中内皮抑素含量,Western blot检测内皮抑素基因在Tca8113和ECV细胞的表达特征。(2)流式细胞仪检测Ad/hEnd感染ECV后的细胞周期及凋亡,WST-1法检测Ad/hEnd对ECV细胞增殖的抑制。(3)Ad/hEnd对荷瘤裸鼠的舌癌的生长抑制分析。结果:(1)实验结果显示感染Ad/hEnd后Tca8113细胞和ECV细胞胞浆内可有效合成内皮抑素蛋白,细胞培养液上清中的内皮抑素蛋白表达浓度呈时间剂量依赖关系,最高达到597 ng/ml,可持续到第7天,并且表达产物有抑制人体静脉内皮细胞ECV生长特性,呈剂量依赖关系。(2)Ad/hEnd可延长感染后的ECV细胞的S期及G_2期,并出现细胞凋亡现象。(3)应用Ad/hEnd后第3天肿瘤体积增长受到抑制,第6天开始肿瘤抑制明显增强,第3周抑瘤率达45.8％。结论:本实?

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。

三七总皂苷抑制肝细胞钙超载的机制

目的通过测定大鼠肝细胞内游离钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ），观察三七总皂苷（ＰＮＧＳ）对肝细胞Ｃａ２＋浓度的影响，探讨其抑制肝细胞钙超载的机制。方法胶原酶分离大鼠肝细胞，Ｆｕｒａ２／ＡＭ技术测定［Ｃａ２＋］ｉ，研究ＰＮＧＳ对静息和被激动状态下肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ的影响。结果１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１血管加压素及１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１血管紧张素分别使肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ增加２００％和９４％，ｖｅｒａｐａｍｉｌ、ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ和ＰＮＧＳ均能不同程度地抑制血管加压素、血管紧张素激动引起的肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高，ＰＮＧＳ的抑制作用显著强于ｖｅｒａｐａｍｉｌ、ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ且呈明显的剂量依赖性。ＰＮＧＳ还能轻度降低静息状态下肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ，而ｖｅｒａｐａｍｉｌ、ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ无此作用。结论ＰＮＧＳ能特异性阻断肝细胞膜上受体依赖性钙通道（ＲＯＣ），抑制肝细胞的钙内流，阻断肝细胞内源性ＩＰ３途径，防止肝细胞内钙超载。ＰＮＧＳ抑制钙超载机制还可能与其本身轻度结合钙离子有关。

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体,为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet/GFP-RV中切获约1.7kb的小鼠T-betcDNA片段,与穿梭质粒pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变,并转染HEK293细胞,出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实:T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中,带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区,并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。

携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

【目的】构建携带 SARS 冠状病毒刺突蛋白 N 端基因片段的重组腺病毒。【方法】从 SARS 病毒 cDNA 扩增刺突蛋白 N 端基因片段(-45～1469nt,截短的 S1区,S_N),插入腺病毒穿梭质粒 pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-S_N。用 Ad-S_N 感染 Vero-E6细胞,通过 RT-PCR 和 Western blot 法检测 S_N 的表达。【结果】克隆的 S_N 基因序列与文献报道基本一致;Ad-S_N 基因组结构与预期一致。在 Ad-S_N 感染的 Vero-E6细胞中存在 S_N 基因的转录和分泌型 S_N 蛋白的表达。【结论】体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒 Ad-S_N 能正确表达分泌型 S_N 蛋白,可用于诱导抗 SARS 免疫的动物实验研究。

B7-1和IL-12基因转染对肝癌细胞免疫原性的影响

目的 观察B7 1和IL 12基因表达对人肝癌细胞免疫原性的影响。方法 分别将B7 1和IL 12基因以逆转录病毒介导转染HepG2细胞。阳性克隆细胞与健康人外周血淋巴细胞 (PBL)混合培养后 ,用流式细胞仪检测PBL表面Ⅰ类人白细胞抗原 (HLA Ⅰ )分子表达 ,以MTT法检测PBL的特异性杀伤活性及杀伤K5 6 2细胞的活性。结果 混合培养后HepG2 /B7 1和HepG2 /IL 12细胞组PBL表面的HLA Ⅰ分子表达分别较HepG2 /neo细胞组增加16 .95 %和 14 .71% (P <0 .0 5 ) ;与HepG2 /neo组比较 ,HepG2 /B7 1组PBL特异性杀伤活性增高 12 .5 % (P <0 .0 5 ) ,HepG2 /IL 12组PBL的特异性杀伤活性无明显增高 (P >0 .0 5 )。HepG2 /B7 1、HepG2 /IL 12细胞活化的PBL对K5 6 2细胞的杀伤活性较HepG2 /neo组分别增高 19.38%和 14 .78% (P <0 .0 5 )。 结论 B7 1和IL 12分子均能增强免疫细胞对肝癌细胞的识别和杀伤 。

腺病毒介导SARS病毒SN基因表达及其诱导的体液免疫

目的检测重组腺病毒Ad-SN在体内外的表达,初步探讨其在大鼠内诱导的体液免疫反应。方法Ad-SN感染Vero-E6细胞后用RT-PCR和WesternBlot法检测SN基因的表达;用WesternBlot法检测Ad-SN在大鼠皮下组织中的表达。Ad-SN皮下免疫大鼠,用ELISA法测定血清中抗SARS-CoVIgG水平。结果在Ad-SN感染的Vero-E6细胞中存在SN基因的转录,其mRNA量呈剂量依赖性;在Ad-SN感染的细胞、其培养上清及Ad-SN注射部位组织中均能检测到SN的表达。在Ad-SN免疫大鼠血清中可检测到高滴度SARS冠状病毒抗体(IgG)。结论Ad-SN能表达分泌型SN蛋白,并在大鼠体内诱导SARS-CoV特异的体液免疫反应。

腺病毒携带人内皮抑素基因在舌癌细胞和血管内皮细胞中的表达

【目的】以腺病毒携带的人内皮抑素基因 Endostatin基因 (Ad/hEnd)感染舌癌细胞株Tca8113和人脐静脉内皮细胞株ECV30 4,观察其在舌癌细胞和静脉内皮细胞株中的表达。【方法】用 2 93细胞扩增Ad/hEnd ,并抽提、纯化。以 10MOI的Ad/GFP感染ECV细胞 ,观察细胞中表达绿色荧光蛋白的细胞所占的比例。采用免疫组化法检测Endostatin蛋白在感染了Ad/hEnd的Tca细胞和ECV细胞中的表达。Ad/hEnd感染Tca细胞后收集细胞培养液上清 ,ELISA检测上清中Endostatin蛋白含量。Western blot检测Endostatin蛋白在Tca和ECV细胞中的表达。【结果】扩增的Ad/hEnd通过空斑形成试验准确测定其滴度可达 1× 1 0 1 0 ～ 8× 1 0 1 0 PFU/mL。表达绿色荧光蛋白的细胞所占的比例为 31 %。实验显示感染Ad/hEnd后 ,在Tca细胞和ECV细胞胞浆内有Endostatin蛋白合成。细胞培养液上清中Endostatin蛋白表达浓度呈时间剂量依赖关系 ,最高达到 5 97μg/L。Western blot检测显示Endostatin蛋白可在两种细胞中高效表达 ,相对分子质量与自然Endo statin蛋白一致 ,无杂合蛋白 ,呈剂量依赖关系 ,且持续到第 7天仍呈明显的Endostatin蛋白质条带。【结论】本实验制备的重组腺病毒Ad/hEnd能在舌癌细胞和血管内皮细胞中有效表达Endostatin蛋白 。

人神经营养素-3受体基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

【目的】构建人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)受体(即酪氨酸蛋白激酶受体C,tyrosineproteinkinaseC,TrkC)基因重组的腺病毒表达载体。【方法】从人脑组织mRNA中扩增TrkC基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的表达盒。再将表达盒与腺病毒骨架DNA(Adeno-XviralDNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-TrkC)。用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-TrkC)。【结果】TrkC基因RT-PCR扩增产物为2478bp。Adeno-TrkC经PCR鉴定为正确重组子。【结论】应用体外连接法已构建了人TrkC重组腺病毒表达载体,这为进一步应用NT-3进行基因治疗中枢神经损伤奠定了基础。

LAK细胞之诱导条件的探讨

目的 探讨 L AK细胞的诱导条件。方法 采用不同含量的 r- IL- 2 T和 PHA制备 L AK细胞 ,经台盼兰拒染实验计数法及 MTT比色法检验 L AK细胞数目及活性。结果 在 r- IL- 2 30 0 μ/ ml和 PHA10 μg/ ml时 ,制备的 L AK细胞数量多 ,杀伤活性较高。结论 结论 r- IL- 2和 PHA可诱导 L AK细胞增殖。

腹腔注射人淋巴细胞建立人肝癌PBL-SCID嵌合模型

目的探索建立人肝癌PBL-SCID嵌合模型的方法.方法 C57/BL SCID小鼠腹腔注射健康志愿者外周血淋巴细胞(huPBL)2×107(1.0 ml),同时右腋部皮下注射5×105(0.2 ml)HepG2细胞.第2、4周鼠尾取血ELISA法测定人IgG含量,用流式细胞仪分析小鼠外周血单个核细胞中人淋巴细胞比例.4周MTT法测定小鼠脾细胞对HepG2细胞的杀伤能力,免疫组化检测小鼠脾脏中人淋巴细胞的存在.结果模型成瘤率为100%,成瘤潜伏期12～18 d.2、4周时小鼠血中人IgG 分别达69.8 μg/ml、125.9 μg/ml,人淋巴细胞占单核细胞的比例分别为10.5%和3.5%.4周时免疫组化检测出人淋巴细胞分布于小鼠脾脏中,小鼠脾细胞对HepG2细胞的杀伤力为20.3%.处死动物,常规病理切片见肿瘤生长.结论 SCID小鼠腹腔注射人淋巴细胞、皮下注射肝癌细胞可建立人肝癌PBL-SCID嵌合模型.

重组人内皮抑素腺病毒抑制肝癌裸鼠移植瘤生长

目的 观察重组人内皮抑素腺病毒(Ad/hEndo)对人肝癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法 人脐静脉内皮细胞ECV-304经Ad/hEndo感染后,western印迹检测人内皮抑素的表达。人肝癌BEL-7402细胞移植到裸鼠背脊部后,检测Ad/hEndo对肝癌移植瘤生长的抑制作用。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中内皮抑素mRNA的表达。分析人内皮抑素在裸鼠体内的表达分布。结果 Western印迹检测到人内皮抑素基因在ECV-304细胞内高效表达。Ad/hEndo明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤生长(F=4.061,P<0.05)。Ad/hEndo组血管密度计数为6.88±1.08,DMEM组为13.60±1.71(t=9.216,P<0.01)。瘤内注射Ad/hEndo后3d,RT-PCR在肿瘤组织检测到内皮抑素mRNA的表达,7d后表达不明显。人内皮抑素蛋白主要分布在肿瘤组织。结论 腺病毒介导的人内皮抑素基因在体内、体外获得高效表达,并明显抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长与血管生成。