球形红细菌无机焦磷酸酶的原核表达、纯化及初步分析

无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,PPase)水解在许多生物大分子的生物合成过程中产生焦磷酸并释放能量,形成的热力学拉力可促进合成反应的进行。球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)无机焦磷酸酶(RsPPase)属于II型可溶性焦磷酸酶,钴离子对于其活性的维持具有重要的功能,而其活性调控及其表达对细菌生长的影响尚未报道。研究克隆、原核表达纯化RsPPase。结果发现,钴离子会导致谷胱甘肽S-转移酶(glutathione sulfotransferase,GST)标签不能进行蛋白酶切,且融合蛋白GST-PPase水解焦磷酸的催化效率较低(Km/kcat=2.0×104mol(/L.s));在球形红细菌胞内表达大肠杆菌焦磷酸酶(Km/kcat=5.5×107mol/(L.s))没有影响细菌的生长,暗示球形红细菌胞内PPase活性足够高。通过对其结构的模拟推测,在钴离子存在的情况下为闭合构象,GST标签的存在可能影响PPase羧基端结构域的运动,而影响其结合底物和释放产物的能力;在钴离子不存在的情况下为开放构象,GST标签具有较大的自由度,可暴露蛋白酶识别位点酶切产生无标签RsPPase。

5'-腺苷磷酰硫酸激酶及其R68K突变体对5'-腺苷一磷酸3'羟基的磷酸化

硫作为生命活动的必需元素,主要以-2价和+6价发挥生物学功能。硫的同化代谢包括胞内活化、转移以及还原等反应。其活化是同化代谢的关键反应,包括ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS)催化硫酸盐与ATP反应生成腺苷-5'-磷酰硫酸(adenosine 5'-phosphosulfate,APS)和焦磷酸(pyrophosphate,PPi)以及腺苷-5'-磷酰硫酸激酶(adenosine 5'-phosphosulfate kinase,APSK)催化APS 3'羟基磷酸化生成3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate,PAPS),APSK催化APS磷酸机理已经较为清楚。利用APSK对AMP的磷酸化进行了初步分析,发现AMP可作为APSK的底物,反应生成3,5'二磷酸腺苷(3'-phosphoadenosine 5'-phosphate,PAP);对APSK的三维结构进行分析发现,R68同时和APS的磷酸根和硫酸根形成氢键,稳定APS的结合,而K侧链基团比R短2.4魡,R68K突变将导致K不能和距离较远的硫酸根离子相互作用,从而减弱APS的亲和力,而增加与磷酸根离子的相互作用,可能提高AMP的亲和力。研究结果表明,R68K突变体的最适底物变为AMP,KmAMP是对照的0.2倍,而催化效率是对照的5倍。以R68K为偶联酶成功测定了具有较低KmPAP的酵母3,5二磷酸核苷酸酶(3',5'-bisphosphate nucleotidase,YND)动力学常数,为分析测定AMP底物的酶活提供了工具。